松杉灵芝分离纯化及ITS分子鉴定

邹莉+孙婷婷+王旭彤+方释慧+王世新+崔嵘

摘要：以采自黑龙江省大兴安岭图强地区的野生松杉灵芝为试验材料，采用组织分离法分别对其菌盖处、菌盖与菌柄交界处和菌柄处的组织进行分离纯化；通过测定生长速度和污染率等方法，研究分离纯化的最适培养基和最佳部位；最后将分离物进行ITS序列分析，计算遗传距离，并采用邻接法构建NJ系统发育树。结果表明，分離纯化最适培养基为PDA+子实体煮水培养基；菌盖与菌柄交界处为最佳分离部位，菌丝生长速度快，菌丝长势好，污染率低；分离物经ITS序列测定，系统发育分析证实其为松杉灵芝。本研究获得了松杉灵芝的纯培养菌株，为松杉灵芝的进一步开发利用提供科学依据。

关键词：松杉灵芝；组织分离；ITS序列分析；系统发育分析

中图分类号： S567.3+10.1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0278-03

松杉灵芝（Ganoderma tsugae Murr.）为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌[1]，是一种生长于针叶树上的灵芝，是灵芝中的上品[2]。松杉灵芝入药在我国已有悠久的历史，是中药宝库中一味珍贵药材，具有增强免疫、抑制肿瘤、保肝解毒、安神健脑、调节消化系统机能、润肺平喘、抗氧化、美容养颜等多种功效[3-4]。近年来，由于人为地无序采摘，加之生态条件的异常变化，目前野生松杉灵芝已到了一芝难求的状况[5]。本研究以采自黑龙江省大兴安岭地区的野生松杉灵芝为试验材料，通过组织分离法对其进行菌种分离纯化以及ITS序列测定，为今后深入研究松杉灵芝和进一步实现人工驯化栽培及产业化发展奠定良好的基础。

1材料与方法

1.1供试菌种

以采自黑龙江省大兴安岭图强林业局过火树桩上的松杉灵芝作为供试种菇，试验材料选择朵形正常、无病害、无虫孔、无破损、生长健壮的子实体。

1.2试验方法

1.2.1培养基的制备

本试验共4种培养基，基础培养基为PDA培养基，碳源为葡萄糖，其他培养基分别添加前人研究的最适氮源和无机盐等作为比较。

PDA培养基（A）：马铃薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1 000 mL，pH值自然。将马铃薯切成1 cm×1 cm×1 cm 小块放于锅中加水煮20～30 min，过滤取滤液，加入葡萄糖与琼脂煮沸4～5 min，分装于三角瓶中，灭菌。灭菌采用高压蒸汽灭菌，121 ℃灭菌20 min。

PDA+酵母膏培养基（B）：在1 L PDA培养基中加入5 g酵母膏[6]配制而成的培养基。

PDA+无机盐培养基（C）：在1 L PDA培养基中加入1 g MgSO4、3 g KH2PO4[7]配制而成的培养基。

PDA+子实体煮水培养基（D）：松杉灵芝子实体用水煮后的滤液代替水配制而成的培养基。

1.2.2子实体不同部位对分离的影响

采集野外过火树桩上的松杉灵芝，选取新鲜尚未完全成熟的子实体作为分离材料，用75%乙醇擦拭2～3遍后置于超净工作台中，在无菌条件下进行菌种分离。用无菌解剖刀分别在松杉灵芝子实体的菌盖、菌盖与菌柄交界处和菌柄处切取菌肉组织块，接种在PDA平板培养基中，每个培养皿接1块菌肉，20组重复，用封口膜进行封口后置于25 ℃恒温培养箱中进行培养，每天观察长势并记录。

1.2.3不同培养基对分离的影响

分别制备“1.2.1”中的4种培养基，对松杉灵芝进行分离培养。从上述试验选出的最佳分离部位处取菌肉接于4种培养基中，每个平板接种1块菌肉，重复20组，于25 ℃恒温培养箱中进行培养，观察菌丝长势并记录。

1.2.4DNA的提取、扩增和鉴定

采用快捷型植物基因组 DNA 提取试剂盒（天根，北京）分别对松杉灵芝的子实体和分离培养得到的菌丝体进行基因组 DNA 的提取。子实体用无菌的接种钩钩取其纯净的菌肉，放于研钵中，加入液氮充分研磨；菌丝体用无菌的小勺在分离培养基上刮取后放于研钵中，加入液氮充分研磨。其余步骤参照说明书。

采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）用于rDNA ITS 区段的 PCR 扩增[8]。扩增体系为50 μL，其中去离子水为35.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，ITS1、ITS4 引物各2 μL，Taq DNA 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 1 μL（浓度20～50 ng/μL）；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃反应7 min。对PCR扩增产物进行电泳检测后送至哈尔滨博仕公司进行测序。

将测序结果在NCBI中作BLASTN比对，找出并下载>95% 相似性序列，用ClustalX 2.0的Alignment程序对所有同源序列进行多重对位排列。用MEGA 5.0软件包进行系统发育分析和进化树的构建。用Kimura2-parame-ter 模式计算遗传距离，所有对位排列结果中的空位或缺失数据作完全删除处理，进化距离分析采用邻位相连法（NJ，neighbor-joining）。系统树的每个分支的统计学显著性分析以自展法进行检验，重复1 000次。

2结果与分析

2.1子实体不同部位对分离的影响

由表1可知，从松杉灵芝子实体的不同部位所取菌肉组织进行培养后，其中菌盖与菌柄交界处的菌丝生长速度与其他2个部位相比差异极显著，菌丝长势最旺盛，生长速度最快，且污染率最低，都显著低于其他2个部位的平均污染率。因此，菌盖与菌柄交界处为最佳分离部位。

3结论与讨论

本试验采用组织分离法对野生松杉灵芝进行分离纯化，结果表明，野生松杉灵芝可在实验室条件下成功分离。通过对子实体分离得出结论：菌盖和菌柄交界处为最佳分离部位，菌丝不但生长致密洁白、生長速度快，而且菌盖和菌柄交界处的菌肉组织与外界真菌及细菌无直接接触，在该部位进行分离，可有效降低菌丝受污染的概率；此外，本试验筛选出最适宜分离的培养基为PDA+子实体煮水培养基，用该培养基进行组织分离能提高菌丝生长速度，原因可能是子实体煮水后含有菌丝生长所必需的营养物质和微量元素。

在核基因组研究中，常用核糖体 DNA 内转录间隔区（internal transcribed spacer，rDNA ITS 区）序列对植物和真菌进行鉴定和系统进化分析[9-11]。在进化过程中 ITS 区所受到的选择压力非常小，并且进化速率较快，在大部分的真核生物中都表现出较为广泛的序列多态性。亲缘关系很近的2个种都能通过ITS序列来显示其差异性，表现出二者的系统进化关系[12-14]。

本试验采用ITS序列比对法进行松杉灵芝菌种的鉴定，其准确性高且简单易行。通过对供试子实体与菌丝体的ITS区段长度进行比对，验证供试菌丝体为松杉灵芝的分离物；构建系统发育树后验证供试菌丝体与Ganoderma tsugae、Ganoderma oregonense有较近的系统发育关系，为今后松杉灵芝的进一步开发利用提供了种质资源与科学依据。

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