维生素E和谷氨酰胺对兔精液获能的影响及获能相关基因的表达

陈梦然+高浩泽+周培培+刘俊+李拥军

摘要：为了探讨不同质量浓度维生素E和谷氨酰胺（glutamine，Gln）对精子获能的影响，以及与获能有关的关键基因在获能后相对表达量的差异，在获能液中加入不同质量浓度的维生素E（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）或Gln（0、5、10、15、20 mg/mL），并分别将其与精子悬液一同培养，以孕酮诱导顶体反应，通过涂片染色镜检得到顶体发生率；采用实时荧光定量PCR得到获能相关基因蛋白激酶A催化亚单位β（PRKACB）和ACP6（acid phosphatase 6，lysophosphatidic）在获能后的表达。结果表明，添加质量浓度为1.0 mg/mL的维生素E对精子顶体发生率的影响显著高于其他组别（P<0.05）；添加质量浓度为15 mg/mL的Gln，精子顶体发生率显著高于其他组别（P<0.05）；与空白对照组相比，维生素E最佳质量浓度处理组（1.0 mg/mL）的PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量显著性降低（P<0.05）；Gln最佳质量浓度处理组（15 mg/mL）处理后，基因[WTBX][STBX]PRKACB、ACP6[WTBZ][STBZ]在获能后的相对表达量高于空白对照组，但差异不显著（P>0.05）。可见，获能液中添加维生素E和Gln对兔精子获能具有一定影响。

关键词：维生素E；谷氨酰胺；精子获能；基因表达

中图分类号： S829.1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0306-03

随着哺乳动物胚胎生物工程技术的深入研究以及商业性胚胎移植技术的迅猛发展，对卵母细胞和胚胎的需求量日益增加[1]，加强对体外受精技术的研究十分必要。精子获能是精卵结合的重要前提，获能效果的好坏直接影响受精效果。学者以小鼠[2]、山羊[3]等为试验材料，对精子获能机理、获能方法等进行了大量研究，从而推动了体外受精技术的发展。

动物精液中带有少量的活性氧（ROS），在进行孵育的过程中，精子的呼吸代谢也会产生一定量的ROS，正常范围内的ROS有助于精子获能，但高浓度的ROS会对精子获能过程造成阻碍。生产中常通过添加抗氧化剂来减少和消除ROS对精子的不利影响[4]。维生素E的主要功能是非特异性的断链抗氧化，因此维生素E能保证细胞膜结构和功能的完整性，也可缓解氧自由基造成的应激[5]。谷氨酰胺是一种重要的氨基酸，参与合成谷胱甘肽。谷胱甘肽对维持生物体内适宜的氧化还原环境具有至关重要的作用。在动物机体内，谷胱甘肽参与对异物和亲电代谢物的去毒，是有效的自由基清除剂，保护细胞免受活性氧复合物的损伤[6]。本试验探讨维生素E和谷氨酰胺对兔精子获能的影响，为进一步提高兔的人工授精效率提供理论及实践依据。

研究表明，蛋白酪氨酸磷酸化（PTP）有利于精子获能，精子中可能存在4种PTP信号传导途径，其中最为重要的是可溶性AC/cAMP/PKA途径。该信号传递路径为：Ca2+、HCO-3等信号离子→可溶性腺苷酸环化（adenylatecyclase，AC）被激活→环磷酸腺苷（cAMP）含量增加→PKA被活化→PKA底物磷酸化→蛋白酪氨酸磷酸化→精子获能[7]。PKA是可溶性AC/cAMP/PKA信号途径中最为重要的关键信号节点，由2个具有调节功能的亚基单位（R）和2个具有催化功能的亚基单位（C）组成，在cAMP的作用下调节亚基并催化亚基分离，使PKA激活，诱发PKA底物磷酸化以及最终的蛋白酪氨酸磷酸化，进而诱导精子发生获能变化。目前已有5个不同的人类C亚单位基因被鉴定，即PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKX、PRKY。PRKACA、PRKACB、PRKX人类C亚单位基因被转录和翻译为功能性蛋白激酶，分别被称为PKA Ca、PKA Cb、PRKX[8]。随着获能进程的推进，精子AC、顶体酶、神经氨酸苷酶等相继被激活。胆固醇流失引起的Ca2+、HCO-3内流激活了AC[9]，最终胞浆内Ca2+缓慢降低，顶体酶原逐渐活化变为顶体酶，激活的顶体酶作用于膜上和膜内相关成分，触发了后续的一系列获能相关反应[10]。其中，酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）是精子获能过程中变化最为剧烈的一种顶体酶类[11]，磷酸酶的激活提高了膜脂代谢率，产生大量溶血磷脂，这些溶血磷脂代谢产生的甘油二脂可激活蛋白激酶，通过调控PTP影响精子获能[12]。溶血磷脂酸性磷酸酶6型（lysphosphatidic acid phosphatase type 6）是一种由基因[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]（acid phosphatase 6，lysophosphatidic）编码在人类基因中的酸性磷酸酶，该基因的表达与溶血磷脂酸性磷酸酶及酸性磷酸酶的活性相关[13]。本试验通过对PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]相对表达量的测定，从而分析维生素E和Gln对精子获能的影响。[LM]

1材料与方法

1.1试验动物

选用体况相近的新西兰大白兔公兔（购自江苏省南京市金陵种兔场）进行笼养，饲喂颗粒饲料，自由饮水，定期补充适量青绿饲料。

1.2主要试剂

维生素E（纯度≥50%）购自上海源叶生物科技有限公司，L-谷氨酸钠（含量≥98.0%）购自北京索莱宝科技有限公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司。FastQuant RT Kit（cDNA第一条链合成试剂盒）、SuperReal PreMix Plus均购自天根生化科技（北京）有限公司。氯化钠、氯化钾、NaH2PO4·H2O、MgCl2·6H2O、氯化钙、葡萄糖、0.2%酚红、青霉素、链霉素、碳酸氢钠、丙酮酸鈉、肝素、BSA、孕酮、考马斯亮蓝染液（CBB）、10×PBS。

1.3精液的采集及顶体反应的诱导

选用体况相近的新西兰大白兔公兔，采用假阴道法进行精液采集。先将采集到的精液进行镜检，保证精子活力在06以上；将精液与获能液按1 ∶[KG-3]（2～3）比例混匀，离心去上清液后在下层精子沉淀中加入1 mL获能液，于CO2培养箱中培养20～30 min；吸取上清液离心后去上清，分别加入含不同质量浓度维生素E（0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）、Gln（0、5、10、15、20 mg/mL）的获能液稀释2～5倍，继续培养2～3 h；向培养后的精液中加入孕酮，使其在培养液中的质量浓度为 1 μg/mL，并继续培养30 min。

1.4考马斯亮蓝法判断顶体反应

精子完成顶体反应后，精子悬液以1 000 r/min离心5 min，沉淀以固定液固定10 min，离心去上清，用10×PBS洗滌2遍。采用适量10×PBS悬浮沉淀，将CBB染色液滴于玻片上染色30 min，采用CBB脱色液冲洗玻片并晾干。采用普通光学显微镜进行观察，随机观察不同视野中的200个精子，并计算其顶体反应率。

2结果与分析

2.1兔顶体反应诱导与维生素E的关系

由图1可知，随着维生素E质量浓度的上升，精子的顶体发生率呈先上升后下降的趋势，当维生素E的质量浓度为 1.0 mg/mL 时，精子的顶体发生率最高，与其他组相比具有显著性差异（P<0.05）。质量浓度为0.5、1.5 mg/mL的处理组与空白组相比，精子的顶体发生率均有所提高，但差异不显著（P>0.05）。质量浓度为2.0 mg/mL的处理组与空白组相比，精子的顶体发生率有所下降，但差异不显著（P>005），

[FK（W11][TPCMR1.tif；S+4mm][FK）]

而与其他试验组相比差异性显著（P<005），可能是由于质量浓度过高的维生素E不利于精子的获能反应。

由图1得出最佳质量浓度为1.0 mg/mL，该质量浓度的处理组与空白组相比，精子获能后PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量均有所下降，且差异性显著（P<0.05）。PRKACB与[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量相比较，二者之间不具有显著性差异（P>0.05）（图2）。

2.2谷氨酰胺对兔精子获能和顶体反应的影响

由图3可知，随着Gln质量浓度的上升，精子的顶体发生率呈先上升后下降的趋势，当Gln质量浓度为15 mg/mL时，精子的顶体发生率最高，与其他组相比具有显著性差异（P<0.05）。质量浓度为5、10、20 mg/mL的处理组与空白组相比，精子的顶体发生率差异性均不显著（P>0.05）。可见，15 mg/mL 为最佳处理浓度。

由图3得出最佳质量浓度为15 mg/mL，该质量浓度的处

理组与空白组相比，精子获能后PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量均有所上升，但差异性不显著（P>0.05）。PRKACB与[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量相比较，二者之间不具有显著性差异（P>0.05）（图4）。

3结论与讨论

本试验采用考马斯亮蓝染色法研究添加不同质量浓度的维生素E、Gln对精子获能的影响，结果表明，获能液中维生素E添加量为0.5、1.5 mg/mL时，精子顶体发生率有所提高，但差异不显著（P>0.05）；当添加量为1.0 mg/mL时，顶体发生率显著提高（P<0.05）；当添加量为2.0 mg/mL时，顶体发生率下降。顶体发生率整体呈先上升后下降的趋势，表明维生素E的质量浓度在一定范围内对精子的顶体发生率具有正向调控作用；当维生素E的质量浓度达到一定量时，精子的顶体发生率会受到一定程度的抑制。试验过程中还发现，高质量浓度维生素E处理后的精子死亡率明显高于其他处理组，表明高质量浓度维生素E对精子具有一定伤害作用。添加Gln的试验结果相似，总体呈先上升后下降的趋势。获能液中Gln添加量为5 mg/mL时，精子顶体率有所提高，但差异不显著（P>0.05）；当添加量为15 mg/mL时，顶体反应率显著提高（P<0.05）。可见，添加一定质量浓度的维生素E或谷氨酰胺可有效清除获能过程中过多产生的ROS，防止精子细胞膜损伤、脂质过氧化、蛋白质磷酸化，从而影响获能，这与Shiva等的研究结论[14]一致。

本试验还采用实时荧光定量PCR得到获能相关基因PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]的相对表达量，结果表明，与空白对照组相比，维生素E最佳质量浓度处理组（1.0 mg/mL）PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因的相对表达量显著性降低（P<0.05）。可见，虽然宏观上最佳处理质量浓度对于精子的顶体发生率具有显著提高作用，但由于机体内部存在反馈机制，过多的基因表达开启了负反馈机制，从而导致相应基因的表达量下调。与维生素E相比，Gln最佳质量浓度处理组PRKACB和[WTBX][STBX]ACP6[WTBZ][STBZ]基因在获能后的相对表达量高于空白对照组，但差异不显著（P>0.05）。可见，Gln在精子获能过程中可促进蛋白激酶A和磷酸激酶的活性，与宏观上Gln最佳质量浓度促进精子的顶体发生率相一致。在获能液中添加1.0 mg/mL维生素E或 15 mg/mL 谷氨酰胺，对兔精子获能具有显著性影响。

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