PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达及意义

涂江江　董翠梅　陶利英　刘秀丽　康马飞

【摘要】 目的：研究PI3K/Akt信号通路在胃癌干細胞中的表达及意义。方法：收集笔者所在医院普外科胃癌切除术患者胃癌组织标本，应用肿瘤球悬浮分选法从组织标本中分选出胃癌干细胞和普通肿瘤细胞。比较两组细胞中PI3K、Akt的蛋白及mRNA的表达情况。结果：RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P<0.05）；Western blot检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的蛋白相对表达量为0.771±0.206和0.601±0.182，明显高于普通胃癌细胞组的0.215±0.012和0.218±0.028，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中存在高表达的现象，表明该通路极有可能参与了胃癌的发生发展。

【关键词】 胃癌； 干细胞； PI3K； Akt

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.2.084 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）02-0154-02

胃癌属于普外科常见的恶性肿瘤，源于胃黏膜上皮细胞[1]。研究发现，肿瘤是一种信号通路疾病。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）是参与肿瘤发生发展的重要细胞信号通路，因此抑制该信号通路成为胃癌靶点治疗和预防转移和复发的关键[2-3]。但目前PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达研究罕见报道。本研究通过收集胃癌切除术患者胃癌组织标本，应用肿瘤球悬浮分选法从组织标本中分选出胃癌干细胞和普通肿瘤细胞，比较两组细胞PI3K、Akt的蛋白及mRNA表达量，以期能够为胃癌的预防和治疗提供新的依据和策略，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集笔者所在医院普外科胃癌切除术患者胃癌组织标本40例。患者年龄为28～53岁，平均（39.5±6.1）岁，所有患者均为首次确诊，均未接受过放疗或化疗，无其他肿瘤病史，无内分泌疾病。CD44、PI3K、Akt抗体均购自美国Abcam公司。小鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 试验方法

胃癌干细胞的原代培养、分化及鉴定：应用肿瘤球悬浮分选法分选组织标本中胃癌干细胞。具体方法为，先用常规方法对组织标本进行脱蜡水化，使用微波炉对组织进行抗原修复，将组织中的坏死组织和血管剔除干净，清洗标本（D-Hanks液）。将组织标本剪碎，再将其消化（胰酶），终止消化后，在离心机中离心，弃上清，将细胞收集、重悬，在其中加入超微磁珠（CD44阳性包被），充分混匀后，将分离株安装于磁场之上，将分选获得的细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子及b27的干细胞培养基中。培养箱的参数设置为：37 ℃，5% CO2，饱和湿度。使用CD44+对胃癌干细胞进行标记，使用免疫荧光染色对胃癌干细胞进行鉴定，阳性表达即可以认为其为胃癌干细胞，染色结果为阴性表达则为普通胃癌细胞。

1.3 实时荧光定量PCR检测两组细胞PI3K、Akt基因的mRNA表达水平

两组细胞的总RNA使用Trizol法提取，内参对照为GAPDH，（PI3K、Akt及GAPDH引物均由苏州金唯智生物科技公司合成）。对总RNA进行逆转录和RT-PCR扩增，荧光定量PCR仪为美国ABI公司，7500型。选用20 μl为扩增体系，试验反应条件：95 ℃、5 min循环1次；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，循环40次；以0.5 ℃从65 ℃逐渐递增至95 ℃。按照2-△△CT计算Notch1 mRNA的相对表达量，每组均设3个复孔，均进行3次重复试验。

1.4 Western blot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达

收集两组细胞，使用常规方法提取总蛋白，储存在-80 ℃冰箱中。取总蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴下以80 V电压转至PVDF膜，时间为1.5 h。PBST缓冲液洗膜3次后，封闭1.5 h。剪膜后加入一抗，4 ℃孵育过夜，兔抗人PI3K抗体、兔抗人Akt抗体的稀释比例均为1∶1000。第2天进行复温，使用PBST摇摆清洗3次后，加入二抗，室内温度条件下孵育60 min。条带结果用凝胶成像分析系统对其进行收集，量化分析用Image J软件进行处理。

1.5 统计学处理

用SPSS 17.0对数据进行分析处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR检测两组细胞PI3K、Akt基因的mRNA表达水平

RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 Western blot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达

Western blot检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的蛋白相对表达量为0.771±0.206和0.601±0.182，明显高于普通胃癌细胞组的0.215±0.012和0.218±0.028，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

图1 Western blot检测两组PI3K、Akt的蛋白表达

3 讨论

胃干细胞是具有自我更新、无限增殖、定向分化能力的细胞。一旦胃干细胞的基因发生突变或者微环境发生改变时，就会出现增殖不受调控的干细胞，向肿瘤干细胞发生转变，引起胃癌的发生[4]。PI3K信号通路在肿瘤的发生、发展上起着重要的调节作用，具有抑制凋亡、促进增殖的关键作用[5]。在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、成神经管细胞瘤等多种人类肿瘤中，均发现有PI3K信号通路的异常活化[6-8]。

对PI3K信号通路进行深入研究，对胃癌的診断及治疗有着深远的意义[9-11]。早期胃癌、中晚期胃癌中PI3K蛋白和Akt蛋白的阳性表达率均较正常胃黏膜组织高，表明PI3K、Akt与胃癌的形成和恶性进展有关，可能主要通过促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡起作用。程玉等[12-13]研究发现，抑制PI3K活性可诱导凋亡的发生。PI3K/Akt通路在胃癌细胞的生长、增殖及转移、侵袭表达方面都具有重要的作用[14]。本课题组推测PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中可能存在异常表达。本次研究中，通过肿瘤球悬浮分选法分选组织标本中的胃癌干细胞，并进行鉴定均呈阳性表达CD44。通过与普通胃癌细胞比较，发现RT-PCR检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的mRNA相对表达量为分别为0.680±0.122和0.513±0.121，明显高于普通胃癌细胞组的0.235±0.086和0.205±0.069，差异有统计学意义（P<0.05）；Western blot检测结果显示，胃癌干细胞组的PI3K及Akt的蛋白相对表达量为0.771±0.206和0.601±0.182，明显高于普通胃癌细胞组的0.215±0.012和0.218±0.028，差异有统计学意义（P<0.05），表明PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中异常激活，可能参与胃癌的发生与发展，但在PI3K/Akt信号通路如何调控胃癌干细胞的增殖、凋亡及侵袭转移上还尚不清楚，需下一步着重探讨研究。

综上所述，PI3k/Akt信号通路在胃癌干细胞中高表达，表明它可能参与了胃癌的发生发展。

参考文献

[1]赖斌，朱陪谦.PI3K/Akt信号通路在胃癌干细胞中的表达研究进展[A].江西省中西医结合学会.江西省2014年中医、中西医结合肿瘤学术交流会暨国家级中医药继续教育项目—中医药治疗肿瘤新进展培训班论文汇编[C].江西省中西医结合学会，2014：3.

[2]陈浩，许浪.信号通路对胃癌干细胞及胃癌发生的影响[J].中国组织工程研究，2013，14（10）：2532-2537.

[3]陈建新，陈雄，欧阳学农，等.胃癌干细胞的研究进展[J].临床肿瘤学杂志，2013，18（10）：952-956.

[4]陈建新，王均惠，彭永海，等.胃癌干细胞的研究现状及发展方向[J].中华肿瘤杂志，2014，36（11）：801-804.

[5]牛磊，郗洪庆，陈凛，等.Lgr5-Wnt/β-catenin信号通路与胃癌干细胞的研究进展[J].解放军医学院学报，2014，35（12）：1268-1272.

[6]李霞，徐桂芳，张伟杰，等.胃癌干细胞的分离鉴定以及干细胞特性研究[J].胃肠病学，2014，10（9）：517-522.

[7]隋华，付晓伶，潘树芳，等.PI3K/Akt/NF-κB通路调控ABCB1/P-gp介导的人结肠癌细胞多药耐药的研究[J].中国癌症杂志，2014，10（2）：106-111.

[8]刘姣，李明春.PI3K/Akt通路与表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂产生耐药性的关系研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（12）：1648-1650.

[9]孙栋勋，蔡志毅.EGFR/PI3K/Akt 细胞信号传导通路与肿瘤[J].检验医学，2014，10（7）：768-773.

[10]解友邦，李建平，冯建明，等.PI3K/Akt信号转导通路和肿瘤[J].国际呼吸杂志，2015，35（19）：1502-1505.

[11]沈存思，范方田，陶丽，等.抑癌基因PTEN与肿瘤血管生成研究进展[J].中国药理学通报，2013，29（5）：597-600.

[12]程玉，李建玲，刘海旺，等.PI3k/Akt蛋白及mRNA在60例胃癌中的表达及意义[J].重庆医学，2015，7（10）：1352-1354，1357.

[13]姜蓬垒，常冰梅.PI3K-Akt信号通路与肿瘤化疗耐药性[J].国际肿瘤学杂志，2014，41（5）：324-327.

[14]费洪荣，赵莹，王桂玲，等.PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡[J].中国病理生理杂志，2013，29（11）：1962-1965.

（收稿日期：2016-09-04）