糖尿病心肌病患者血清APE1的表达改变和意义

郭润民　吴子君　黄瑞娜

【摘要】 目的：探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE1）在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）患者血清的表达改变和意义。方法：收集对照、糖尿病和DCM患者血清，ELISA法检测血清APE1的表达，FAM荧光标记法检测血清APE1的酶活性。结果：与对照组、糖尿病组相比，DCM组患者血清APE1的表达明显增加，而其DNA核酸内切酶活性显著降低。结论：表达增加而DNA修复功能减退的APE1可能参与糖尿病心肌病的发病过程。

【关键词】 糖尿病心肌病； 脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1； DNA修复功能

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and significance of APE1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1） in diabetic cardiomyopathy（DCM） patients.Method：Levels of APE1 in serum were assayed by ELISA kit.Enzymic activity of serum APE1 in DCM patients was measured using FAM labeled fluorescence assay.Result：Serum levels of APE1 were dramatically elevated in DCM patients compared with the control group and the diabetes group，endonuclease activity of APE1 significantly lower than those of the control group and the diabetes group.Conclusion：Elevated serum APE1 with its DNA repair dysfunction might be involved in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy.

【Key words】 Diabetic cardiomyopathy； Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1； DNA repair function

First-authors address：Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.002

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病獨立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变的一种心脏并发症，是糖尿病患者心血管疾病高发生率及高病死率的重要原因[1-2]。氧化应激、DNA氧化性损伤、心肌细胞凋亡等因素与DCM发病密切相关，其中氧化应激及DNA氧化性损伤是DCM的主要发病机制之一[3-4]。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1，APE1；即氧化还原因子-1，redox factor-1，ref-1），是维持细胞内氧化还原平衡和修复DNA氧化性损伤的双功能蛋白酶[5-9]。近年来国内外研究发现：APE1在肺癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等肿瘤的发病中可能有重要作用，也与神经退行性疾病、脑卒中以及冠心病的发病及严重程度关系密切[10-12]。然而，在DCM心肌损伤中的具体作用及机制尚不清。因此，本研究拟DCM患者血清APE1表达改变和意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 DCM诊断标准与血液样本采集 选择2013年7月-2016年7月在广东医科大学附属医院心血管内科住院的糖尿病心肌病患者30例，健康者60例，单纯糖尿病患者60例。诊断标准参考文献[1-2]报道，具体如下：确诊糖尿病病程5年以上；心脏扩大、心力衰竭、心绞痛或心律失常存在；冠脉造影排除冠状动脉血管病变；无其他原因的心肌病和心脏病。排除急性脑梗死患者、自身免疫性疾病、使用激素或免疫抑制剂者、发病前2周有炎症、感染性疾病、依从性差不能完成相关指标测定的患者。本研究经广东医科大学附属医院伦理委员会审核通过，均获得参与本研究所有患者的知情同意书。采集DCM患者空腹外周静脉血10 mL，将其置于不含抗凝剂的收集管中，室温静置30 min后，4000 r/min离心20 min，离心留取上清低温冰箱保存备用。

1.2 双抗体夹心ELISA法检测血清APE1的表达 取DCM患者血清100 μL加入预先用APE1抗体包被的酶标板中，37 ℃孵育90 min，然后吸出培养基，加入APE1抗体继续孵育60 min，经TBS漂洗3次，加入生物素标记的二抗，反应30 min，采用TMB法显色，经终止液终止反应后，用酶标仪记录各孔450 nm的吸光度（A）。取3孔的平均数，按标准曲线计算APE1的表达。

1.3 FAM荧光标记法检测血清APE1的核酸内切酶活性 首先，寡脱氧核糖核苷酸（寡核苷酸）带有荧光基团（6-FAM基团）和淬灭基团（Dabcyl荧光淬灭基团）在FAM（BHQ1）-GCA CTXAAG AAT TCA CGC C A T GTC GAA ATT CTT AAG TGC–Dabcyl的5和3末端，X或者是四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF），或者是胸腺嘧啶残基（作为对照），上海生工合成（上海生工，中国）。本寡核苷酸具有5和3末端互补形成的茎环结构双链核酸。荧光基团可被邻近的淬灭基团淬灭，具有99%的淬灭效能。20 μL 500 nM 890-FAM（BHQ1） oligo和20 μL APE1蛋白样品加入96孔板。混合后，分别于0、5、10、15、20、25、30、40 min采用LB 940 Multimode Microplate Reader（Berthold Mithras，德国）测定，激发波长490 nm，发射波长525 nm。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者一般资料 选择2013年7月-2016年7月在广东医学院附属医院心血管内科住院的糖尿病心肌病患者30例（DCM组），健康者60例（对照组），单纯糖尿病患者60例（糖尿病组），三组患者一般资料比较，见表1。

2.2 糖尿病心肌病患者血清APE1表达的改变 血清APE1水平测定采用ELISA方法，与对照组、糖尿病组相比，DCM患者血清APE1的表达明显增加，见图1。

2.3 糖尿病心肌病患者血清APE1核酸内切酶活性的改变 血清APE1核酸内切酶活性测定采用FAM标记的荧光方法，与对照组、糖尿病组相比，DCM患者血清APE1的DNA核酸内切酶活性显著降低，见图2。

3 讨论

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病引起的心脏并发症，独立于高血压、冠心病及心脏瓣膜病变，机制主要是心肌代谢紊乱所致的心肌细胞死亡，临床表现为心肌收缩和舒张功能下降、心律失常甚至心力衰竭[1-2]。近年来，全球糖尿病的发病率逐年升高，DCM是糖尿病患者心血管疾病高发生率及高病死率的重要病因，它的防治有待解决。已有研究表明：氧化应激、DNA损伤、心肌细胞凋亡等是DCM发病机制，但其详细的发病机制尚未明确[3-4]。

高糖、高脂和高胰岛素等代谢紊乱能引起心肌细胞发生氧化应激，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多，ROS可以直接或间接攻击蛋白质、脂类和DNA，形成8羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）和AP位点（apurinic/apyrimidinic sites）等DNA氧化性损伤产物，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1）是针对DNA氧化损伤进行碱基切除修复（base excision repair，BER）的关键修复酶，在哺乳动物细胞中，APE1 承担了大于95%的AP核酸内切酶活性[5-9]。APE1在肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等腫瘤的发病与预后密切相关，也与神经退行性疾病、脑卒中以及冠心病的发病及疾病严重程度关系密切[6-9]。APE1在肿瘤组织的高表达与部分肿瘤患者预后差呈正相关，这可能与APE1参与肿瘤细胞耐药、血管形成、放疗耐受等有关[13-17]。前期有报道显示：糖尿病及其并发症患者氧化应激及DNA损伤增加（如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等），并且与血糖控制和预后关系紧密[18-20]；然而，DCM患者DNA损伤和APE1表达及活性的变化尚未见报道。本研究首次发现：DCM患者血清APE1的表达明显增加，而其DNA核酸内切酶活性显著降低。

但是，血清APE1表达及其酶活性改变与DCM患者心肌损伤之间的关系还需要深入探讨，如在DCM动物和细胞模型的验证APE1表达及功能，深入分析APE1表达及功能与DCM患者心功能和心肌损伤的直接关联，这将有助于阐明APE1在DCM心肌损伤中的直接作用和相关机制。

综上所述，APE1表达增加而DNA修复功能减退可能参与糖尿病心肌病心肌损伤的发生发展。深入研究APE1表达及功能变化在DCM发病中的具体作用及机制，以及与DCM诊断和预后的关系，均将有助于阐明DCM的发病机制和找到DCM的防治新策略。

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（收稿日期：2016-09-30） （本文編辑：程旭然）