玉米肽对双歧杆菌免疫力作用的影响

张智，林秀芳，马建章，*，郑喜群

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔161006）

玉米肽对双歧杆菌免疫力作用的影响

张智1，林秀芳1，马建章1，*，郑喜群2，*

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040；2.齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔161006）

检测复合益生菌（长双歧杆菌＋青春双歧杆菌＋动物双歧杆菌）与复合益生菌-玉米肽对小鼠免疫功能及抗氧化的影响。将小鼠随机分为空白组、复合菌高、中、低3个剂量组和复合菌-玉米肽高、中、低3个剂量组。SPF级昆明系小鼠分别经口每日连续灌胃30天后，对免疫器官、碳粒廓清指数、迟发型变态反应、脾淋巴细胞增殖实验和体液酶联免疫进行测定。碳粒廓清指数测定实验中，复合菌和复合菌-玉米肽的高剂量组高于对照组。脾淋巴增殖实验中，复合菌和复合菌-玉米肽制剂高剂量组刺激指数高于对照组，差异有显著性意义，说明该样品具有增强细胞免疫功能作用。迟发型变态反应，复合菌-玉米肽高剂量组明显优于其他组。体液酶联免疫测定实验方法中，复合菌和复合菌-玉米肽制剂高剂量组优于对照组，说明该样品具有促进免疫球蛋白A的功能。由此可见，摄入一定量的复合益生菌和复合益生菌-玉米肽，可增强小鼠的免疫能力，说明该样品具有增强免疫力的功能作用。抗氧化能力的测定主要通过测定小鼠血清的SOD酶活性和MDA含量。结果表明，与对照组相比，复合菌和复合菌-玉米肽能够提高SOD酶活性、降低血清中MDA含量，具有一定的抗氧化能力。

玉米肽；复合益生菌；免疫；抗氧化；影响

根据研究人体90%的疾病与免疫有关，故免疫系统在抵御外界环境有害物质入侵方面起着至关重要的作用。免疫反应的调节在预防疾病方向起着至关重要的作用。越来越多的人们对这方面愈加重视。最近有研究表明，免疫调节剂可增强机体防御反应，此方式是一项有效增加对疾病抗性的方式[1]。已有研究表明乳酸杆菌（LAB）对肠道菌群有一定的调节作用，具有一定的免疫功能。证明益生菌对免疫条件作用有一定的影响[2]。通过食用河蟹，能提高免疫力与抗病能力[3]。说明提高免疫的同时，也能提高抗病能力。

益生菌（Probiotic）又称活菌制剂，是有益的的细菌或真菌。益生菌能够促进宿主肠道内微生物菌群的生态平衡，对宿主生理功能和健康产生都有一定的促进作用[4]。益生菌具有减缓乳糖消化不良[5]、治疗腹泻[6]、激活免疫系统、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]等多种保健功能。双歧杆菌一直被公认为是安全的益生菌，对机体健康没有致病性，具有食品安全性。长双歧杆菌（Bifidobacrium Longum）是一种专性厌氧菌，已有研究表明长双歧杆菌可以增强机体的免疫力[9]。青春双歧杆菌（Bifidobacrium adolescent）是一种严格厌氧菌，已有研究证明其免疫功能。张炳华[10]等研究表明环磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的恢复和增强作用。动物双歧杆菌（Bifidobacrium animalis）被认为是一种严格专性厌氧菌。已有研究表明含动物双歧杆菌的益生菌酸乳便秘症状有所改善[11]。

免疫佐剂（immunoadjuvant）是指能够先于抗原或与抗原同时作用，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型[12]。已证明玉米肽也是一种较好的提高免疫力的物质。罗军[13]等研究玉米肽对辐射大鼠的作用，结果表明玉米肽能够促进大鼠外周血象的影响，提高机体免疫力。单一益生菌由于其严格厌氧特性的制约，很难发挥其很好的免疫作用，因此希望通过加入其他物质以提高其免疫活性，更好地应用于生产实际。目前此三种双歧杆菌复合菌及复合菌-玉米肽的免疫活性与抗氧化能力少见报道。本试验主要探究复合菌[长双歧杆菌∶青春双歧杆菌∶动物双歧杆菌（质量比）=1∶1∶1]及在此基础上添加玉米肽的复合菌制剂（质量比＝1∶1∶1∶1）的免疫功能及抗氧化能力，旨在更好地提高复合益生菌的免疫及抗氧化能力，为研制新型免疫佐剂提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

昆明系清洁级雄性小鼠，体重18 g～22 g，6周龄～ 8周龄。玉米肽：由齐齐哈尔大学食品与生物工程学院提供。

1.2 仪器与设备

YQX-Ⅱ厌氧培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1G超净工作台：江苏净通净化设备有限公司；JA2003型电子天平：上海精科仪器有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司；DHP-9272型恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；DL-6M型立式离心机：湖南星科科学仪器有限公司；RT-6000全自动酶标仪：Rayto；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；YXQG02手提式压力蒸汽灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；免疫球蛋白IgA试剂盒、免疫球蛋白IgG试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒：购自南京建成生物制剂公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制备

取斜面保存的菌种，经活化、MRS培养基斜面培养，培养得到长双歧杆菌（Bifidobacrium Longum）BL-01、青春双歧杆菌（Bifidobacrium adolescent）BA-10及动物双歧杆菌（Bifidobacrium animalis）BA-30。然后将这三种菌种分别于改良培养基37℃培养24h，3500 r/min离心10min，除去上清，收集菌体沉淀。烘干，冷冻干燥得到菌粉。收集冷藏备用。将三者等比例混合得到复合益生菌。再按照一定比例混合玉米肽，得到复合益生菌增强剂。

1.3.2 小鼠喂养及分组

灌胃前适应环境一周。将小鼠随机分为正常对照组、复合菌低剂量组、复合菌中剂量组、复合菌高剂量组、复合菌-玉米肽制剂低剂量组、复合菌-玉米肽制剂中剂量组和复合菌-玉米肽制剂高剂量组。正常对照组灌胃生理盐水，每天灌胃0.2mL/10 g。饮用水为无菌水。饲料为普通饲料。自由采食。每天换水。隔天换垫料。连续灌胃30 d。记录体重变化。

1.3.3 免疫器官

各组小鼠末次灌胃给药，第2天称重记录。所有小鼠眼眦取血于无抗凝剂的离心管中，3 000 r/min离心10min，分离得到血清。小鼠脱臼处死，取其脾脏和胸腺，用生理盐水进行清洗，去除表面的血迹，并用滤纸擦干表面。称重记录脾脏与胸腺的重量[14]。

脾脏（胸腺/肝脏）指数=脾脏（胸腺/肝脏）质量/小鼠体重

1.3.4 碳粒廓清指数

参照其他试验方法，略作改动[15]。小鼠称重，用印度墨汁（10mL/kg，用前稀释3倍～4倍）由尾静脉注入体内，观察墨汁注入小鼠体内成功后，立即计时。间隔时间分别为2min及10min时，分别以毛细管取眼眦静脉丛取血20μL，注入盛有2mL 0.1%的Na2CO3溶液的比色皿中，测定OD600并记录，以Na2CO3溶液作为空白对照。将小鼠脱臼处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重，计算吞噬指数α。

式中：OD1为2min时的吸光值；OD2为10min时的吸光值；t1为2min；t2为10min；k为廓清指数。

1.3.5 迟发型变态反应

参照方笋的试验方法[16]，略作改动。预先将小鼠腹部脱毛，首次将1%二硝基氟苯（DNFB溶液）（以体积比=1∶1的丙酮麻油溶液配制）定量取50μL致敏小鼠。第五天再用DNFB涂右耳致敏，24 h后处死动物剪下小鼠的左右耳壳，用打孔器取直径8mm的相同部分的耳片，分别称重，用左右耳的重量之差来代表迟发型变态反应（DTH）的程度。

1.3.6 脾淋巴细胞增殖实验

参照郭淼[17]的实验方法，略作改动。将小鼠脱臼处死，75%乙醇中浸泡10min，无菌条件下取脾，制备成细胞悬液，经筛网过滤，清洗两次，1000 r/min离心10min，弃去上清液。加入RPMI-1640培养液调整细胞密度为5×106个/mL，用台酚蓝染色计数（活力应大于95%）。将每一份脾细胞悬液分两孔加入96孔培养板中，一孔加5μL伴刀豆球蛋白A促细胞分裂剂，另一孔作为对照，置于37℃CO2培养箱中培养48 h。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）进行细胞计数实验，加入MTT（5mg/mL）10μL/孔，继续培养4 h。待培养结束后，离心，吸出上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜（DMSO），混匀，使紫色结晶完全溶解，于波长570 nm处测定吸光度，计算刺激指数SI。

式中：SI为刺激指数；a为ConA组在570 nm处的吸光值；b为对照组在570 nm处的吸光值。

1.3.7 体液免疫试验

小鼠脱臼致死，取血清。采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白G的含量。

准备试剂、样品和标准品，加入样品和标准品，生物素标记二抗和酶标试剂，37℃保温反应60min，洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10min，加入终止液，10min之内读完OD值（450 nm）。计算免疫球蛋白含量。

1.3.8 抗氧化活性测定

小鼠采用摘除眼球的方法取血，3 000 r/min离心10min。获得血清。之后按照试剂盒的要求测定小鼠血清中SOD和MDA。丙二醛采用TBA法进行测定。总超氧化物歧化酶采用羟胺法测定。

1.3.9 数据处理

采用excel2010、origin8.5处理数据和SPSS21.0中One-way ANOVA分析，各组数据用平均值±标准差表示，以P＜0.05为统计学意义上的差异。

2 结果与分析

2.1 脏器指数

脏器指数的变化见表1。

表1 脏器指数的变化Table1 The varities of weights of spleen and thymus

实验过程中，小鼠无死亡现象，活动正常，无异常现象，脱臼处死后，脾脏、胸腺等器官无异常现象。脾脏指数中，与空白对照组相比，复合菌高、中剂量组显著增加（P＜0.01）；复合菌-玉米肽高、中剂量组显著增加（P＜0.01）。胸腺指数中，复合菌与复合菌-玉米肽均无显著性差异（P＞0.05）。说明复合菌与复合菌-玉米肽对脾脏影响显著，对胸腺影响差异不显著。肝脏指数中，复合菌中剂量组与对照组存在显著差异（P＜0.05）。复合菌高剂量组与低剂量组与对照组差异不显著（P＞0.05）。复合菌-玉米肽高剂量组与对照组比较差异显著（P＜0.01）。复合菌低剂量组无明显差异变化。

2.2 碳粒廓清指数

碳粒廓清指数的变化见表2。

表2 碳粒廓清指数Table2 Carbon granule clearance assay

如表2所示，复合菌3个剂量都能够显著地提高，复合菌-玉米肽只有高剂量组能提高小鼠地碳粒廓清指数，低剂量组与中剂量无法提高该指数。与空白组相比，复合菌3个剂量组存在极显著差异（P＜0.01），复合菌-玉米肽只有高剂量组存在显著差异（P＜0.05），中剂量组和高剂量组无明显差异（P＞0.05）。证明复合菌与复合菌-玉米肽都能提高碳粒廓清指数，具有对细胞免疫有一定的调节，且存在一定的剂量依赖。

2.3 迟发型变态反应

迟发型变态反应的变化见表3。

表3 迟发型变态反应Table3 The varities of DHT

迟发型变态反应（DHT）属于Ⅳ型变态反应，是由T细胞介导的炎症免疫反应。当皮肤接触到一些小分子半抗原物质，半抗原可与皮肤蛋白结合形成完全抗原，激活对抗原敏感的T细胞，当机体再次接触致敏原。如表3所示，复合菌与复合菌-玉米肽对小鼠迟发型变态反应有一定的影响。复合菌中剂量组与空白对照组存在显著差异（P＜0.01）。复合菌高剂量组与低剂量组与对照组差异不显著。复合菌-玉米肽高、中、低三个剂量组与空白组都存在显著差异（P＜0.01）。在一定的剂量范围内，复合菌与复合菌-玉米肽能够促进小鼠的细胞免疫，且玉米肽佐剂的加入能够显著提高DHT指标。

2.4 脾淋巴细胞增殖试验

脾淋巴细胞增殖试验的变化见表4。

表4 脾淋巴细胞增殖试验Table4 Plaque forming assay

如表4所示，复合菌高剂量组与中剂量组能够提高脾淋巴细胞刺激指数，与空白对照组相比，高剂量组存在极显著差异（P＜0.01）。复合菌-玉米肽能够显著提高脾淋巴细胞刺激指数，与空白对照组相比，低剂量组存在不显著差异（P＞0.05），中剂量组和高剂量组存在极显著差异（P＜0.01）。证明复合菌与复合菌-玉米肽都能提高脾淋巴细胞刺激指数，且随着剂量的增加，刺激指数增大，免疫活性增强。

2.5 体液酶联免疫

体液酶联免疫的变化见表5。

表5 分泌型免疫球蛋白Table5 The varities of IgA and IgG

分泌型球蛋白对肠道黏膜防御起着重要作用，是防御病原菌在肠道黏膜黏附的第一道防线，对机体的健康状况起着重要的作用。如表5所示，与空白对照组相比，复合菌-玉米肽高、中、低剂量组存在显著性差异（P＜0.01）；复合菌制剂高、中剂量组与空白对照组相比差异显著（P＜0.01）。说明复合菌与复合菌-玉米肽能够在一定程度上促进免疫球蛋白A。如表5所示，免疫球蛋白G整体呈增长趋势。与空白对照组相比，复合菌高、中剂量组存在极显著性差异（P＜0.01），复合菌低剂量组无显著性差异。复合菌-玉米肽中剂量组与对照组相比存在显著性差异（P＜0.01）。低剂量组无显著性差异（P＞0.05）。说明玉米肽的加入有助于提高免疫球蛋白G的含量，有助于提高机体抵御外界致病菌的侵入。

2.6 抗氧化指标

小鼠脱臼致死，取血清，按照试剂盒说明书方法进行实验。抗氧化指标的变化见表6。

表6 抗氧化指标Table6 The varities of antioxidation

机体内酶与非酶系统不断产生能攻击生物细胞膜中的多不饱和脂肪酸的氧自由基，从而引起脂质的过氧化。脂质的过氧化最终形成醛基、羟基、酮基等新的氧自由基。氧化产物过多会引起核酸、蛋白质等大分子物质的聚合，从而具有一定的毒性，对人体造成伤害。丙二醛（MDA）含量的多少反应了机体的氧化损伤程度，是评价机体代谢的重要指标。SOD酶活性是作为评价药物抗衰老的重要指标，是生物体体内重要的生物酶之一。

如表6所示，复合菌与复合菌-玉米肽的MDA含量总体呈下降趋势。与空白对照组相比，复合菌高、中低剂量组能够降低血清中的MDA含量。复合菌-玉米肽高剂量和中剂量组能够降低血清中MDA含量。与空白对照组相比，复合菌低剂量组存在差异显著（P＜0.05）。复合菌-玉米肽制剂高剂量组能够显著降低小鼠血清中MDA含量，结果存在差异性显著（P＜0.01）。复合菌中剂量组与对照组相比存在显著差异（P＜0.05）。复合菌-玉米肽中剂量组与对照组存在极显著差异（P＜0.01）。说明玉米肽佐剂的加入能够显著提高SOD活性。

3 结论

益生菌具有多种生理功能，不仅能够有效地调节机体的微生态平衡，而且能够提高机体免疫力，提高抗病性，是一种有效的提高机体健康的物质。双歧杆菌更是被公认为安全无毒的益生菌。但是单一的双歧杆菌的活性受限，为了更好的提高双歧杆菌的活性，本试验采用复合双歧杆菌，以期能够更好的提高生物效价，玉米肽的加入作为免疫增强剂，也能高效地促进双歧杆菌的免疫活性的发挥。机体正常菌群在机体内保持着动态平衡，这种动态平衡对机体的免疫作用的正常发挥以及生命活动都是起着至关重要的作用。机体免疫活性的正常发挥对机体的稳定起着重要的作用。玉米肽氨基酸的组成中谷氨酰胺的含量很高，谷氨酰胺是构成蛋白质的氨基酸，同时也是合成核酸的氮源，与组织生长、修复密切相关。虽非必需氨基酸，但在提高机体免疫力、维持肠道黏膜正常结果和功能等方面起着重要的作用。淋巴细胞是重要的免疫器官，脾脏是机体重要的免疫器官。含有大量的T淋巴细胞及B淋巴细胞。所以测定脾淋巴细胞的增殖情况对于研究免疫而言起着重要的作用。碳粒廓清试验中发现复合菌与复合菌-玉米肽制剂能够提高碳粒廓清指数。迟发型变态反应试验中，玉米肽的加入提高了复合双歧杆菌的刺激T细胞的能力。脾细胞细胞增殖试验中，复合菌与复合菌-玉米肽制剂高剂量结果呈差异性显著。能够有效的促进脾淋巴增殖。免疫球蛋白A是机体内较为常见的蛋白。免疫球蛋白A的含量一定程度上反映机体的免疫情况。复合菌-玉米肽制剂高剂量组度都能促进机体内免疫球蛋白A。抗氧化能力主要测定SOD活性与MDA含量，试验结果表明复合菌和复合菌-玉米肽能够提高SOD活性，降低MDA含量。结果表明复合菌与复合菌-玉米肽制剂有一定的抗氧化能力。双歧杆菌为常见的益生菌，对人体起着重要的作用。玉米肽的加入能够有效地提高双歧杆菌的免疫活性与抗氧化能力，为接下来的研究提供一定的参考。

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The Effect of Corn Peptide on Immunity Function of Bifidobacriums

ZHANG Zhi1，LIN Xiu-fang1，MA Jian-zhang1，*，ZHENG Xi-qun2，*
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

The research was mainly about the immunity function of complex probiotics（Bifidobacrium Longum＋Bifidobacrium adolescent＋Bifidobacrium animalis）and complex probiotics-corn peptide.Mice were randomly divided into seven groups including blank control group，three groups treated with compound probiotics liquid at different doses and three groups treated with complex probiotics-corn peptide at different doses.Mice（SPF grade from Kunming）were continuously eaten after 30 d.The methods for immunity function were relative to weights of spleen and thymus，carbon granule clearance assay，plaque forming assay，DHT，and Elisa.Through the carbon granule clearance experiment，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide have obvious changes compared with the control team.Through the splenic lymphocyte proliferation experiment，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide have markedly obvious changes compared with the control team. The experiment showed that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide enhanced certain parameter of splenic lymphocyte function.Through DHT experiment，the results implied that complex probiotics-corn peptide have changes compared with the control team.Through the Elisa experiment，the experiment implied that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide could enhance IgA.In conclusion，complex probiotics and complex probiotics-corn peptide could be able to enhance mice immunity function.The measures of antioxidation function were the content of MDA and the activity of SOD.The results showed that complex probi－otics and complex probiotics-corn peptide could reduce the content of MDA and improve the activity of SOD. The experiment showed that complex probiotics and complex probiotics-corn peptide had antioxidation function.

corn peptide；probiotics；immunity；antioxidation；effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.003

2016-11-12

大熊猫国际资金项目（SG1409）；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GA13B201）

张智（1964—），女（汉），教授，博士，研究方向：微生物与发酵工程。

*通信作者：马建章（1937—），男（汉），教授，博士，研究方向：主要从事野生动物生态管理与自然保护区方面的研究；郑喜群（1963—），男（汉），教授，博士，研究方向：农产品加工及应用酶学。