脑缺血预处理对大鼠蛛网膜下腔出血后细胞凋亡的影响

罗仁国 段 劫 赵 龙 熊 平 段军伟

（川北医学院附属医院神经外科，四川南充 637000）

脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）即一次或多次短暂的非致死性脑缺血可诱导缺血脑组织对今后一定时间段的脑缺血损伤产生耐受性。一系列相关实验已证实短暂缺血预处理可以激发或动员机体的潜在防护能力，对随后的严重缺血缺氧产生强大的保护作用[1]。动脉瘤性蛛网膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，SAH）具有高致死性及高致残性，有12.4%的患者在就诊前即已死亡，多达40%～60%的患者在首次出血的48 h内死亡，而脑组织缺血缺氧在疾病的发生发展过程中扮演了重要作用。本研究拟通过对实验性SAH大鼠进行缺血预处理，观察SAH大鼠神经元细胞凋亡及神经行为学的变化情况，探讨缺血预处理在SAH中的作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

本研究采用Sprague-Dawley成年雄性大鼠（300 g,川北医学院实验动物中心）。所有大鼠于24℃下12 h明暗周期下饲养，操作程序均按动物使用和管理委员会的当地指南进行，并按照中国国家动物福利法给予处死。共78只大鼠随机分为6组：A组（n=6，正常对照组）；B组（n=18，假手术组）；C组（n=18，缺血预处理组）；D组（SAH组）；E组（n=18，缺血预处理1天后SAH组）。除A组外，其余各组再根据实验终止时间不同分为1、3、7 d三个亚组，每亚组6只。

1.2 缺血预处理操作方式

参照经典四血管阻断法加以改良后建立大鼠全脑缺血预处理模型。实验动物在术前一天禁食，术前6 h禁饮。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔内注射麻醉。大鼠取仰卧位，固定四肢及头部，于颈部锁骨上正中线切开皮肤约15 mm，钝性分离皮下组织，游离暴露双侧颈总动脉和锁骨下动脉起始部，用无损伤动脉夹夹闭180 s。预处理后用稀释庆大霉素盐水冲洗创面并逐层缝合。动脉夹闭期间，观察实验大鼠对疼痛刺激的反应、瞳孔对光反射及翻正反射，以判断脑缺血模型是否成功。入选大鼠应保证瞳孔对光反射消失，对疼痛刺激无反应，翻正反射消失。假手术组只分离动脉而不夹闭。

1.3 缺血预处理后蛛网膜下腔出血模型的建立

缺血预处理3 min后3 d行蛛网膜下腔出血模型法造模。采用视交叉池注血法建立蛛网膜下腔出血模型。麻醉Sprague-Dawley雄性大鼠。给大鼠插管，维持呼吸道通畅。用电热垫维持大鼠体温为（37±0.5）℃。采用脑立体定向方法导入定点于中线前囱前6.5 mm处，与垂直面呈30°角。使穿刺针头的孔口向右，针头落下使针尖直达至颅底、视交叉前2～3 mm处。在股动脉穿刺取血，抽取250 μL血液，3 min内匀速注射入视交叉前池。此后，保持大鼠麻醉状态约1 h，使之从颅内刺激中逐渐恢复。于每只大鼠解剖取脑时再次证实SAH。在观察期间内，定时监测大鼠生命体征。

1.4 实验大鼠行为学改变观察及评分

分别于预定时间对各组大鼠按照Longa评分[2]标准进行神经行为学评分。活动正常且无神经功能缺损者记0分；出现竖毛或轻度运动低下者记0.5分；不能完全伸直前肢或后肢者记1分；肢体瘫痪或行动不协调、追尾者记2分；不能站立或行动时向一侧倾倒者记3分；无自发性运动或有明显意识障碍者记4分。

1.5 神经细胞凋亡的检测

大鼠造模术后按相应时间段快速断头处死，完整取出脑组织，并保持蛛网膜完整性。经10%福尔马林固定、漂洗、脱水、透明、石蜡包埋后，在视交叉后1 mm及4 mm处冠状切开鼠脑（切片包含脑干和基底动脉）。切片进行TUNEL染色，采用双盲法在400倍光学显微镜下，观察大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡率（TUNEI染色细胞阳性率）。海马CA1神经元细胞凋亡率=海马CA1区TUNEI染色阳性细胞数量/海马CA1区神经元细胞数量*100%。切片中正常神经元细胞TUNEL染色呈蓝色，胞核相对较大，形态大小较一致。凋亡神经元细胞TUNEL染色呈棕色，形态呈浓缩或点片状，不规则，大小不一致。

1.6 统计学处理

应用SPSS 16.0 统计学软件进行资料分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，两组均数比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，采用SNK法进行两两比较；计数资料比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为学观察及神经行为评分

D组及E组实验大鼠出现不同程度的行为异常，可表现为纳差、反应迟钝、自洁能力差、毛发杂乱、自主运动减少、颈项强直，部分大鼠出现意识障碍、肢体瘫痪、抽搐甚至角弓反张。大鼠神经行为学异常以SAH后的1、3 d最为明显，后逐渐缓解。D组神经行为学评分最高，与其他各组相比，差异有明显的统计学意义（P＜0.05）；E组各时间点神经行为学评分均较D组低，差异有统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 各组间实验大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡率的检测

A，B，C组海马神经元细胞未见或仅有极少量TUNEL染色阳性凋亡细胞；D，E，F组海马神经元细胞出现明显的凋亡现象，其中以SAH后第3天时最为突出。各亚组实验大鼠海马神经元细胞凋亡率见表2。A，B，C各亚组实验大鼠海马神经元细胞凋亡率无统计学差异（P＞0.05）。各时间点E组神经元凋亡率均低于D组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

3 讨论与结论

蛛网膜下腔出血是多种病因引起的脑底部或脑、脊髓表面血管破裂导致急性出血性脑血管疾病，血液直接流入蛛网膜下腔，又称原发性或自发性SAH。约90%的自发性蛛网膜下腔出血由颅内动脉瘤破裂引起，由于出血迅速，可短期内引起颅内压急剧升高，导致严重的脑损害，多达40%～60%的患者在首次出血的48 h内死亡[3]。其脑损伤机制既包括早期脑损害，又包括迟发性缺血性损害，在脑保护药物、手术技巧、手术策略等研究相同的条件下，疾病的预后主要由脑组织缺血缺氧能否得到有效干预有关。

表1 各亚组实验大鼠相应时间段的神经行为学评分值表（x±s）

表2 各组大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡率（x±s）

缺血预处理由Murry[4]在心肌缺血实验研究中首先发现。报道指出，通过亚致死性的短暂缺血处理，诱导缺血组织产生内源性保护机制，可以使机体在一定程度上减轻再次发生的缺血性损伤。随后Kitagawa[5]等用沙土鼠全脑缺血模型实验证实了通过脑缺血预处理也可诱发脑组织产生缺血耐受现象。目前，脑缺血预处理的研究多采用的是单次或重复短暂缺血来观察随后致死性缺血所引起的脑损伤情况。研究表明，预处理的效应可表现为早期保护效应和延迟保护效应，早期保护效应发生在预处理后数小时内，主要与腺普受体激活和钾通道开放相关；延迟保护效应多在预处理后2～4 d内达到高峰[6，7]。因此，我们在本实验中在缺血预处理3 d后进行蛛网膜下腔出血建模。实验结果显示：D组神经行为学改变评分最高，与A，B，C组比较有统计学意义（P＜0. 05），说明采用视交叉池注血成功建立了SAH模型，且大鼠出现了明显的神经行为学改变，这种变化在造模后3 d最为明显，7 d时有所恢复；与D组相比，E组大鼠虽然也出现了神经功能变化，但其程度在1、3、7 d亚组均较D组轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明缺血预处理可以减轻实验大鼠SAH后神经功能障碍，对SAH后脑损害有保护作用。对于其神经保护机制，我们观察并比较了海马区神经元凋亡情况。结果显示，3 min缺血预处理即可造成海马区神经元出现凋亡现象；D组SAH后大鼠海马CA1区正常神经元细胞密度较低，神经细胞凋亡明显增加，而E组大鼠海马CA1区虽然也可观察到明显的掉网现象，但是凋亡率较D组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验结果提示脑缺血预处理可以显著降低海马CA1区神经元凋亡。

综上，我们通过动物实验验证了缺血预处理对SAH大鼠缺血脑组织有明显的保护作用，可以明显改善神经功能障碍程度，其机制与增加脑组织对缺氧的耐受性，减少神经细胞凋亡有关。

[1] 王国峰，刘伯芹，赵玉芳，等. 缺血预处理对脑缺血大鼠血管内皮生长因子表达及微血管密度变化的影响[J]. 中国卒中杂志，2011，6（11）：869-875.

[2] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84-91.

[3] 杨彬彬，唐晓平，赵龙，等.高压氧对大鼠蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛的影响[J].中华临床医师杂志（电子版），2016，10（7）：974-977.

[4] Murry CE，Jenings RS，et al.Preconditioning with ischemia dalay of lethal cell injury in myocardium[J].Circulation，1986，74（5）：1124-1127.

[5] Kitagawa K，Matsumoto M，Masafumi Tagaya，et al."Ischemic tolerance" phenomenon found in the brain[J].Brain research，1990，528：21-24.

[6] Valentim LM，Geyer AB，Tavares A，et al.Effects of global cerebral ischemia and preconditioning on heat shock protein 27 immuno content and phosphorylation in rat hippocampus[J].Neuronscience，2001，107：43-44.

[7] 李建民，赵雅宁，安超旺，等.脑缺血预处理对沙鼠前脑缺血再灌注后HSP70表达水平及学习记忆能力的影响[J]. 第二军医大学学报，2010，31（1）：55-59.