MRI评价肾纤维化形态学变化的实验研究

田小娟 邢 伟 陈 杰 张京刚 查婷婷 林英楠

肾纤维化是慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）终末期的常见结局[1]，也是肾移植失败的最常见原因[2]。因此，早期诊断、治疗纤维化对于减缓和逆转慢性肾病的进程，改善肾脏功能，提高肾病患者的生活质量具有重要意义。目前，多采用动物实验的方法进行肾纤维化的相关研究，所用实验动物包括大鼠、小鼠等[3-4]。兔肾较大，左肾位置低且表浅，较适合进行MRI扫描。本研究将探讨肾纤维化兔模型的建立，以及采用MRI常规检查T2WI评价梗阻侧肾脏形态学变化，同时以病理学作为金标准探讨不同时间段输尿管梗阻发生的机制，为临床提供客观依据。

方法

1.实验动物与分组

取健康新西兰大白兔40只，雌雄不限，4～5月龄，体重2.4～2.7kg，完全随机分为假手术组（n=8）和手术组（n=32）。手术组又以梗阻时间不同随机分为2周、4周、6周及8周组，每组8只。所有兔均单笼放置，全价饲料喂养，自由进食和饮水。

2.动物模型的建立

手术组：3%戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉后，将实验兔固定于手术台上，左侧卧位，术区剃毛、消毒，铺无菌洞巾。行左侧腹切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露腹腔，找到左侧肾脏和输尿管，用眼科镊托起输尿管上段部位并分离，分别在左侧输尿管近肾盂处用 4号丝线结扎两处，两处结扎间隔0.5cm，不离断输尿管。手术后将肾复原，逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤。

假手术组：不结扎输尿管，其余步骤同手术组。

3.MRI设备及参数

采用 Siemens Verio 3.0T 磁共振扫描仪。所有实验兔分别于建模前及建模后的2、4、6、8周行磁共振扫描，左侧卧位，头先进，6通道腹部线圈，范围从左肾上极至左肾下极，中心线位于左肾门层面。扫描序列包括冠状位、轴位T2WI。扫描参数：冠状位T2WI：TR1400ms，TE93ms，层厚3.0mm，反转角160°，FOV 154mm×219mm，分辨率126×256，层间距0.9mm，带宽781 Hz/pixel；轴位T2WI：TR1000ms，TE 108ms，层厚4.0mm，反转角138°，FOV130mm×130mm，分辨率179×256，层间距0.8mm，带宽199 Hz/pixel。

4.图像处理

正常肾脏在T2WI表现为内髓高信号，外髓内带明显低信号，外髓外带稍高信号，皮质稍低信号，各部位分界清楚，以外髓外带为界以外为肾皮质，以内为外髓内带和内髓。应用德国SiemenSyngo后处理站，在“viewing”界面打开轴位T2WI序列，由同1名高年资 MRI诊断医师采用盲法阅片，对数据进行两次测量取平均值。选取轴位T2WI肾门最大层面作为测量层面，按照肾皮质、肾实质走形手工绘制感兴趣区(region of interest，ROI)，在各ROI内测量肾皮质面积A1（cm2）、肾实质面积A2（cm2）。

5.病理学检查

扫描结束后采用耳缘静脉注射空气法处死实验兔，立即取出双肾，用37℃生理盐水清洗后，观察记录肾脏大小、形态、颜色、积水程度等。于肾蒂层面正中横剖肾脏，然后将标本置入10%的中性福尔马林溶液中固定24h，行常规脱水、浸蜡、包埋、切片处理，并进行HE染色，光镜观察分析。

6.统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，所有计数资料以± s 表示。采用单因素方差分析比较假手术组和手术组肾脏各时间点A1值、A2值的差异，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 肾脏各时间点T2WI图像特点

假手术组各时间点和手术组建模前T2WI表现为肾脏体积正常，肾盂、肾盏无扩张，皮髓质分界清楚。手术组建模后2周T2WI表现为梗阻侧肾脏体积增大，肾盂及上段输尿管扩张，肾实质变薄，肾皮质增厚；建模后4周T2WI表现为梗阻侧肾脏肾盂明显扩张，肾小盏扩张，肾实质明显变薄，肾皮质较2周时变薄；建模后6～8周T2WI表现为梗阻侧肾脏肾盏明显扩张并融合，肾实质呈“壳”状，肾皮质明显变薄（图2）。

图1 A1为肾皮质面积，手术组于建模后2周时升高，4～8周时逐渐降低；假手术组无明显变化。A2为肾实质面积，手术组于建模后2～8周逐渐降低；假手术组无明显变化。

2.肾脏各时间点A1值、A2值特点

假手术组各时间点的A1值、A2值差异无明显统计学意义（P＞0.05）。手术组各时间点A2值逐渐减小，A1值2周时升高，4～8周时逐渐降低，各时间点A1值、A2值差异有统计学意义（P＜0.05）（表1，图1）。

3.病理学检查

图2 A～D.分别为手术组建模后各时间点左肾T2WI图像。A.建模后2周肾盂扩张积水，肾实质变薄，肾皮质增厚。B.建模后4周肾盂明显扩张，肾实质明显变薄，肾皮质较2周时变薄。C、D.建模后6～8周肾盏扩张并融合，肾实质呈“壳”状，肾皮质明显变薄。E～H.分别为手术组建模后各时间点左肾中心横断面图。E.建模后2周左肾体积明显增大，肾盂扩张。F～H.建模后4～8周肾盂肾盏明显扩张，皮髓质分界不清。I、L.分别为手术组建模后各时间点左肾肾皮质病理学观察（HE染色×200）； I.建模后2周肾皮质增厚，J、K.建模后4～8周肾皮质逐渐变薄。

表1 各组实验兔建模前、后各时间点行MRI-T2WI扫描的A1值、A2值（ x± s ）

3.1 大体表现：假手术组和手术组建模前左肾体积正常，颜色鲜红，肾脏剖面观可见肾盂肾盏无明显扩张，皮髓质分界清楚。手术组建模后左侧肾脏体积逐渐增大，呈苍白色，梗阻以上输尿管明显扩张，肾脏剖面观可见肾盂肾盏明显扩张，皮髓质分界不清，肾实质面积逐渐减小（图2）。

3.2 显微镜下表现：假手术组和手术组建模前左肾肾小球结构正常，肾小管管腔清晰，肾间质无充血、水肿，无炎性细胞浸润。手术组建模后2周左肾肾小球结构基本正常，肾小管明显扩张，管腔增大伴上皮细胞肿胀；建模后4周肾小球肿胀，可见少量玻璃样变性，肾小管部分萎缩，结构辨认不清；建模后6周肾小球明显变性、坏死，肾小管萎缩加重、管腔内可见条索状纤维组织；建模后8周肾小球旁有条索状纤维组织增生，肾小管几乎萎缩消失，被纤维样结构取代。建模后2周时，肾间质增宽，炎症细胞、成纤维细胞浸润，后随时间推移逐渐加重，纤维化逐渐形成。建模后2周时肾皮质增厚，第4～8周逐渐变薄（图2）。

讨 论

肾纤维化是临床上的常见病，是多种慢性肾脏疾病最终导致肾功能衰竭的主要病理改变和共同通路[5]。原发性肾小球疾病、慢性肾盂肾炎等疾病均可导致肾纤维化[6]。目前对于肾纤维化的诊断方法主要是肾活检和肾功能血生化检查。但肾活检是有创性检查，血生化检查对于分肾功能以及肾纤维化的实际状况评价价值有限，而MRI具有高软组织对比、高分辨率、无创性等特点，可以清晰显示输尿管梗阻后肾脏形态学变化，如肾盂、肾盏、输尿管的扩张等。因此本研究将T2WI用于肾纤维化的研究中，在不用对比剂的情况下评价肾纤维化的形态学变化。

肾纤维化模型制备方法有：单侧输尿管结扎（UUO）、肾切除动物模型、药物诱导模型等。肾切除动物模型死亡率高，药物诱导模型技术要求高，且对用此模型进行的相关研究的评价尚无统一标准[7]。目前UUO为较理想的实验动物模型[8]。常用的肾纤维化动物模型多为大鼠和小鼠等，因鼠肾脏体积小，不利于MRI反复检查，因此在本实验中我们采用了新西兰兔行左肾UUO模型法。

随着输尿管梗阻时间的延长，肾小球滤过率进行性降低，肾盂内压力持续上升[9]。本组实验中肾实质的面积随着梗阻时间的延长逐渐减小，与单侧输尿管梗阻后肾盂内压力逐渐升高有关。其机理可分为两方面：首先由于肾小管内压力升高，通过球-管反馈使肾内缩血管物质活性增强，导致肾组织缺血缺氧；其次由于缩血管物质对出球微动脉的收缩作用强于入球微动脉，导致肾小球内压力升高，血液排入肾小管。以上两方面原因导致肾小球崩解，肾小囊萎缩变形，肾小管管腔闭合，最终导致整个肾单位的破坏、消失，因此随着梗阻时间的延长，肾单位破坏逐渐增多，肾实质萎缩逐渐加重[10]。同时国内外研究表明单侧输尿管梗阻后对梗阻侧肾脏的病理改变主要为肾小管上皮细胞及肾间质细胞凋亡导致的肾实质萎缩和纤维化[11]，这与本实验研究结果一致。

本实验结果显示，手术组建模后2周时肾皮质增厚，主要因为该阶段梗阻肾处于炎症反应阶段，病理上表现为肾小管扩张伴上皮细胞肿胀，肾间质增宽、炎症细胞浸润。在该阶段患者无不适症状，如规范治疗，病情可完全逆转。建模后4～8周时肾皮质逐渐变薄，主要因为该阶段梗阻肾处于纤维化形成阶段，病理上表现为肾小球逐渐变性、坏死，肾小管管腔内纤维组织增生，肾间质内纤维细胞增多、纤维化逐渐形成。在该阶段患者肾功能受损，如持续规范治疗，病情可出现逆转，否则将最终导致肾功能衰竭。相关研究如韩文文等[12]观测了犬输尿管梗阻后1周，梗阻侧肾小球结构基本正常，肾小管上皮细胞肿胀变性，肾间质基本正常；梗阻后4周，肾小球出现少量萎缩、退化，肾小管明显扩张，肾间质内炎症细胞浸润；梗阻后8周，肾小球上皮细胞内纤维结缔组织增生。以上研究表明输尿管梗阻后肾脏经历炎性反应阶段和纤维化形成阶段，炎症反应阶段，肾皮质增厚，后由于纤维化逐渐形成，肾皮质逐渐变薄。

综上所述，单侧输尿管梗阻可成功建立肾纤维化兔模型，T2WI能准确地反映单侧输尿管梗阻肾纤维化兔模型的形态学变化，为临床观察和诊断提供一种有效的影像学检查方法。

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