肺真菌病的临床诊断与实验室检查进展

施毅，史家欣

(1.解放军南京总医院呼吸与危重症科，南京 210002；2.连云港市第一人民医院呼吸科，江苏连云港 222002)

肺真菌病的临床诊断与实验室检查进展

施毅1，史家欣2

(1.解放军南京总医院呼吸与危重症科，南京 210002；2.连云港市第一人民医院呼吸科，江苏连云港 222002)

肺真菌病是临床上一种常见病，其发病率不断增加，但临床诊断和治疗依然较为困难，病死率居高不下。肺真菌病的诊断，特别是早期诊断一直是临床研究的热点。肺真菌病目前主要采取分级诊断和治疗。肺部真菌感染以曲霉、念珠菌及隐球菌多见。实验室检查主要以痰和分泌物的涂片和培养、穿刺标本的病理检查、真菌抗原和抗体检测以及核酸检测等方法为主。一些新的检查技术，如宏基因组检测和现场快速评估技术(ROSE)等也在进一步探索当中。病原快速检测指导目标治疗技术也是今后的发展方向。

肺真菌病；诊断；实验室检查；病原体

随着免疫抑制人群的增多，抗菌药物的广泛应用，肺真菌病的发病率不断增加，但临床诊断和治疗依然较为困难，导致病死率居高不下。因此，肺真菌病的诊断，特别是早期诊断仍然是临床研究的热点。本文对近年来肺真菌病的临床和实验室诊断进展作一介绍。

1 肺真菌病的临床诊断

根据2007年中华医学会呼吸病学分会制定的《肺真菌病诊断与治疗专家共识》[1]，中国侵袭性肺真菌病(invasive pulmonary fungal diseases, IPFD)工作组经反复讨论，参照欧美国家的相关诊断和治疗指南，结合中国国情，制定出 IPFD的诊断标准和治疗原则与专家共识，明确提出临床诊断IPFD时要充分结合宿主因素，除外其他病原体所致的肺部感染和类似临床表现的肺部疾病，并将诊断分为确诊(proven)、临床诊断(probable)及拟诊(possible)3个级别。其目前仍然是指导中国真菌感染诊治的主要参考依据，要点如下。

1.1诊断依据 (1)宿主因素：外周血中性粒细胞减少(<0.5×109/L，且持续>10 d)，或体温>38 ℃，或<36 ℃，伴有近期内中性粒细胞减少、曾接受或正在接受免疫抑制药治疗、有免疫缺陷病或应用免疫抑制药病史。(2)临床特征：主要为侵袭性肺曲霉感染的特征性胸部影像学改变，肺孢子菌肺炎两肺出现毛玻璃样肺病变征象，伴有低氧血症；次要特征为肺部感染的症状和体征、新出现肺部浸润影、积极抗菌治疗无效的发热等。(3)微生物学检查：如合格痰液、支气管肺泡灌洗液(BALF)直接镜检发现菌丝，真菌培养2次阳性，发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体；血液标本半乳甘露聚糖(GM)和1，3-β-D-葡聚糖(G)试验检测连续2次阳性；血液、胸腔积液标本隐球菌荚膜多糖抗原阳性等。

1.2诊断标准 (1)确诊：至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征，血培养或无菌腔液真菌培养阳性，或组织病理学改变。(2)临床诊断：至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征，1项微生物学检查改变。(3)拟诊：至少符合1项宿主因素，肺部感染的1项主要或2项次要临床特征。

1.3新的指南问世 近年来，欧洲感染病学会更新了真菌感染诊治指南。美国感染性疾病学会(IDSA)没有发布统一的真菌感染诊治指南，而是分别制定了念珠菌、曲霉、隐球菌感染诊治指南。其要点体现在“从经验走向目标”：如果作为血液系统恶性肿瘤，由于存在高危因素(主要是严重的中性粒细胞缺乏)，真菌感染发病率高，应尽早做出诊断，强调早期经验性治疗以降低病死率，而非粒细胞缺乏患者，由于不同真菌病原体感染有不同的临床表现和相对特异的诊断方法，因而更强调明确诊断后的目标治疗。

2 肺真菌病的危险因素及常见致病真菌

绝大多数肺真菌病患者有免疫功能异常，在经典高危人群如白血病、艾滋病、骨髓干细胞移植及实体器官移植等患者中，IPFD的发病率高达20%～40%[2]。还有一部分内、外科危重病患者，属于非经典高危人群，由于严重的基础疾病、心血管疾病等手术指征和范围的扩大、各种导管的体内介入与留置，以及广谱抗菌药物和糖皮质激素的广泛应用等，导致患者免疫屏障受损与功能障碍而引发IPFD。值得注意的是，非粒细胞缺乏患者肺部真菌感染者也不在少数。表观正常人隐球菌感染常见，甚至有患者体检发现肺部病灶，最后活检才确诊为隐球菌病。Meersseman等[3]报告，长期使用糖皮质激素治疗、慢性阻塞性肺病(COPD)、肝坏死、实体器官肿瘤、HIV感染、肺移植术后、长期接受免疫抑制药治疗的系统性疾病等均为曲霉感染的危险因素，其危险程度虽不及粒细胞缺乏那么严重，但更为广泛和常见，涉及的人群也更多。其他危险程度较低的因素还有严重烧伤、其他实体器官移植术后、使用糖皮质激素治疗、长期滞留ICU、营养不良和心脏手术后等。特别需要强调的是，COPD患者由于存在严重的结构性病变，黏液纤毛清除功能受损，加之长期接受糖皮质激素和广谱抗生素治疗，气道内容易发生曲霉定植，而我国多数医院都存在不间断的基础建设或改建形成的环境因素，故COPD已被认为是IPFD的重要危险因素，而且病死率非常高[4]。

根据我国目前的流行病学资料，在非血液恶性疾病患者中肺真菌病主要有肺曲霉病(37.9%)，肺念珠菌病(34.2%)，肺隐球菌病(15.6%)，肺孢子菌病(4.8%)，肺毛霉病(2.1%)，肺马尔尼菲蓝状菌病和组织胞浆菌病[5]。

3 肺真菌病的临床实验室检查

3.1痰和分泌物的涂片和培养 痰是呼吸道感染病原学诊断最常用的临床标本，而痰标本采集方法的正确与否、痰标本是否合格同样是真菌培养能否检出病原菌的关键。痰可行革兰染色或相关特殊染色(如荧光染色)进行镜检。革兰染色法是非特异性的真菌染色方法，可在一定程度上提高菌丝的识别率。某些特异性染色，如六胺银染色(GMS)和过碘酸-希夫染色(PAS染色)可应用于曲霉、毛霉和念珠菌等真菌病原体染色，且两者联合染色能够进一步提高真菌病原体的检出率[6]。呼吸道标本如发现曲霉或毛霉菌丝临床意义较大。念珠菌由于在口腔定植非常常见，涂片发现念珠菌假菌丝和出芽孢子时应特别注意排除口腔局部定植或感染，如果考虑将其作为下呼吸道感染病原学的诊断依据时须非常谨慎，必须与临床危险因素、血清标志物(如G试验)和培养结果等相结合进行综合判断。

经纤支镜引导保护性毛刷(PSB)技术可减少标本污染，有更好的准确性和可重复性[7]。还可经纤支镜取得BALF进行镜检、真菌标志物检测及培养等。但需要特别提醒临床和实验室高度注意的是，直接纤支镜检和灌洗时如果患者口腔准备做的不好或是没做，则下镜时极易将口腔定植菌带入支气管腔内而导致假阳性结果。因此，行纤支镜检查时务必做好口腔处理，如常规给予银尔通等漱口并清理鼻腔，可大大减少口腔定植菌带入支气管内的风险，提高检测结果的可靠性。

痰培养念珠菌阳性往往难以区分定植或感染，故临床意义有限，其阳性结果解释须慎重，即使经纤支镜下PSB取得的标本培养阳性也不能作为诊断侵袭性念珠菌感染的依据。但在合格痰标本、诱导痰或BALF中，直接镜检发现大量出芽菌体和念珠菌菌丝，再结合培养阳性结果，可以提示临床此时念珠菌处于快速繁殖期而有可能作为感染致病原，有一定的临床指导意义。

合格痰标本、气管内吸引物、BALF或刷检标本镜检发现较为特异的曲霉菌丝，痰标本培养连续2次分离到同种曲霉及BALF的单次培养阳性，可作为诊断肺曲霉病的微生物学依据[8]，但临床医生仍应注意将结果与宿主因素和临床特征相结合来判定其临床意义。需要指出的是，曲霉涂片结果远不如培养的阳性率高。

隐球菌感染以新型隐球菌常见，常用染色方法包括HE染色法、墨汁染色法、PAS染色法和GMS染色法等。墨汁染色通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌，是涂片中检查隐球菌感染的首选方法，也可用于快速排查，但该方法不适合用于黏稠的呼吸道分泌物。痰液、气管吸引物培养隐球菌阳性可以作为诊断的重要依据。但需要注意的是，由于新型隐球菌可以寄居于健康人群，因此，同样应结合临床具体情况判断是否为感染。

与其他真菌不同，肺孢子菌肺炎(PCP)的诊断较为困难，因为肺孢子菌无法通过可靠的培养方法检出，所以其感染的主要确诊方式是通过多种染色技术直接观察到病原体，其具有很高的特异性。目前常用于肺孢子菌包囊和滋养体检测的染色方法有GMS染色法、瑞-吉姆萨染色法、巴氏染色法、免疫荧光染色法等。其中最常用的是GMS染色法、免疫荧光染色法，均敏感且特异。PCP诊断最可靠的依据是在BALF或诱导痰中直接镜检发现病原体[9]。

3.2穿刺标本的病理诊断 组织病理学检查是确诊真菌感染的重要手段，被称为“金标准”，可通过经皮肺穿刺活检、细针抽吸、开胸肺活检、经纤支镜肺活检、经纤支镜防污染毛刷获取标本。

3.2.1曲霉感染 病变早期为弥漫性渗出性改变；晚期为坏死、化脓和肉芽肿形成。病灶内可找到大量菌丝，分支呈45°角，菌丝穿透血管可引起血管炎、血管周围炎及血栓形成等，血栓形成可致组织缺血、坏死。

3.2.2隐球菌感染 病变与病期早晚有关。早期形成胶样病灶，炎症反应轻微，病灶中可见大量隐球菌；晚期病变呈肉芽肿性，有纤维组织增生，大量的巨噬细胞、淋巴细胞、异物巨噬细胞充斥其中，细胞质内可见隐球菌。

3.2.3念珠菌感染 基本病理变化是以单核细胞为主的肉芽肿性炎症。早期以渗出为主，有巨噬细胞、上皮样细胞等浸润；晚期则为肉芽肿形成及若干灰色微小脓肿。病灶内可找到孢子和假菌丝。血管受累呈急慢性血管炎改变，易破裂出血。

3.2.4肺孢子菌感染 肺实变，体积增大，外观呈不规则结节状或棘状。肺泡上皮细胞增生，Ⅰ型上皮细胞可呈退行性变、细胞脱落和肺泡壁坏死，但无化脓性改变；Ⅱ型上皮细胞肿胀。肺间质充血水肿、肺泡间隔增宽。间质中淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润，亦可见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

3.3真菌抗原和抗体检测

3.3.1GM GM是曲霉细胞壁上的一种多聚糖，在曲霉侵犯组织早期就可释放入血，可持续1～8周，最高灵敏度达1 ng/mL，是目前用于诊断侵袭性肺曲霉病(IPA)的一种可靠的方法，可对血清、BALF标本进行检测[10-11]。在粒细胞缺乏患者中已经证实GM检测诊断IPA的敏感性和特异性都在90%左右。但对非粒细胞缺乏患者IPA诊断，血清GM试验的敏感性仅为50%或更低[5，12]。因此，在非粒细胞缺乏患者血清GM试验阴性时不能排除IPA，还应结合其他检查，主要是BALF培养来评估和确定IPA的诊断。近年来，BALF的GM试验越来越受到人们的重视。有研究报告，BALF的GM试验的敏感性为88%、特异性为87%[13]。南京总医院对肺曲霉病患者同时检测血清和BALF中的GM(cut off值≥0.5为阳性)，证实BALF的GM敏感性(75.7%)明显高于血清GM(37.8%)[14]。建议有条件的医院应常规开展BALF中GM检测，非常有助于临床的早期诊治。阳性界值目前尚无统一规定，美国食品和药品监督管理局(FDA)以1.0而欧洲国家多以0.7或0.8作为诊断界值。

GM在血液系统恶性肿瘤及肝细胞移植曲霉感染患者中的敏感性和特异性高于实体器官移植感染者[10]。动态监测GM变化更有助于诊断及治疗效果的评估。需要注意的是，使用哌拉西林/他唑巴坦后可导致血液GM滴度明显上升，牛奶等某些高蛋白食物中可能含有GM抗原，亦可引起短暂的GM滴度升高，需要临床警惕。

3.3.2G G是大多数真菌的细胞壁成分，但隐球菌、接合菌(主要是毛霉属)除外。血清G试验诊断IPFD的敏感性达80%，特异性达82%[15]。需要注意的是，透析使用纤维素膜、蘑菇多糖和血液蛋白质制品会导致G试验滴度升高，导致假阳性结果。

3.3.3隐球菌荚膜多糖抗原 采用乳胶凝集法检测患者血液中隐球菌荚膜多糖抗原可用于诊断隐球菌感染，有报道其诊断肺部隐球菌感染的敏感性和特异性可达96.2%和99.4%，非常值得在临床推广应用。近年来，采用胶体金方法快速检测(15 min)隐球菌荚膜多糖抗原，并可行半定量检测，其敏感性和特异性与乳胶凝集法相当，期望能尽早普及开展。

3.3.4特异性真菌抗体 包括念珠菌抗体、曲霉抗体等，多用于回顾性研究或慢性真菌感染的辅助诊断。粒细胞缺乏患者由于免疫功能缺陷往往不能产生抗体或在疾病早期尚未形成抗体，故进行血清曲霉抗体检测没有临床意义。但非粒细胞缺乏患者通常发病较为缓慢、免疫状态尚可，进行血清抗体检测在许多情况下具有辅助诊断价值，甚至接近确诊价值。如在诊断肺曲霉球、慢性肺曲霉病(CPA)和变应性支气管肺曲霉病(ABPA)等时[8]，主要检测指标是血清曲霉特异性IgM、IgG、IgE类抗体，其中曲霉特异性IgG在CPA的诊断中具有接近确诊的价值。目前国内有些研究者正在开展曲霉IgG类抗体检测的临床实验，但尚无批准上市的抗体检测试剂盒，能检测的主要是血清曲霉特异性IgE类抗体，后者仅对ABPA有诊断价值。因此，需要尽早开展此项检测工作并进一步评估其临床诊断价值。

其他快速检测(胶体金法)尚有血清抗念珠菌烯醇化酶特异性抗体检测、曲霉细胞外糖蛋白检测等，均显示了良好的临床应用前景。

3.4现场快速评估(rapid on site evaluation, ROSE)技术的应用 ROSE在肺及纵隔病变的活检中是一项非常有用的辅助技术。穿刺标本经过快速固定，进行快速HE或Diff-quick染色，镜检，首先确认所取得的标本是否合格，再对标本进行相关染色。若怀疑真菌感染，则需要送微生物培养及特殊染色。此技术对于提高真菌检出率、减少不必要的穿刺有重要价值。

3.5核酸检测 PCR技术在真菌检测方面具有特异性强、快速、准确的优点，但费用高、操作复杂，存在假阳性等问题。有研究发现，应用PCR技术检测患者BALF标本诊断IPA的敏感性和特异性分别为88%和75%，具有一定的临床价值[16]。尤其实时定量PCR(RT-PCR)，不需凝胶电泳，操作过程简化，污染机会减少，具有一定的应用前景。但是由于缺乏标准化的操作方案导致报道的研究结果之间差异较大，目前尚不能应用于临床诊断，仅供临床医师在具有高危因素的患者诊断时谨慎参考[17-18]。

1998年首次提出了针对特定环境样品中全部微生物的基因组总和进行研究的宏基因组(metagenome)概念。宏基因组测序以特定环境中全部微生物群落作为研究对象，不需要对微生物进行分离培养，而是提取环境微生物总DNA作为研究对象，摆脱了传统研究中微生物分离培养的技术限制。采用高通量测序技术，对18S进行测序可以进行真菌鉴定，展示了良好的应用前景。

此项技术尚在研究中，需要解决的技术难题包括样本处理、结果解释(和临床验证)、数据分析等，目前离临床应用尚远。此外，病原快速检测只能适应经验性用药，尚无法满足目标用药，这也是今后诊断技术研究的方向。

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2017-09-10)

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.02

施毅，1956年生，男，教授，主任医师，博士研究生导师，主要从事肺部感染、肺癌、呼吸危重症、慢性气道炎症性疾病相关研究。

R446.5

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