基于非酒精性脂肪性肝病机制及治疗的动物模型研究进展

陈艳珍， 陈成良， 田 兴， 焦 健

(吉林大学中日联谊医院 消化内科， 长春 130033)

基于非酒精性脂肪性肝病机制及治疗的动物模型研究进展

陈艳珍， 陈成良， 田 兴， 焦 健

(吉林大学中日联谊医院 消化内科， 长春 130033)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是以过量脂质在肝细胞内堆积为特征的连续疾病谱，可由单纯的肝脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎，并可进一步进展为肝纤维化、肝硬化、甚至肝细胞癌。动物模型可模拟不同病因以及NAFLD每个阶段的组织病理学和病理生理学改变，为了解NAFLD发病机制和治疗措施提供关键性的指导。目前尚缺乏能完整模仿疾病谱的理想动物模型，介绍了NAFLD及相关肝癌的最常用和最新的动物模型，并结合动物模型中NAFLD的实验性发病机制总结了可能的治疗靶点，希望能为进一步探讨NAFLD发病机制和治疗提供依据。

非酒精性脂肪性肝病； 模型， 动物； 综述

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征在肝脏的表现形式，与肥胖[1]、胰岛素抵抗(IR)[2]、空腹高血糖症、血脂异常、脂肪因子变异等机体代谢异常明显相关[2]，是目前慢性肝病最常见的病因[3]。NAFLD是以过量的脂质在肝细胞内堆积为特征的连续疾病谱，可由单纯的肝脂肪性变性发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，严重时可发展为肝纤维化和肝硬化[4]，NASH一旦合并肝纤维化或肝硬化则可进一步增加肝细胞癌(HCC)的发生风险[5]。

到目前为止，NAFLD的确切发病机制尚不清楚，也缺乏特异性的治疗措施，因此针对发病机制和潜在治疗药物的研究是目前该领域的热点。动物模型可通过模拟不同的病因以及NAFLD每个阶段的组织病理学和病理生理学改变，为了解NAFLD发病机制和进展提供关键性的指导。本文分别针对NAFLD不同的发展阶段综述了最常用的三类动物模型，即单纯肝脂肪变性动物模型、NASH动物模型、NASH相关HCC动物模型，希望为NAFLD动物模型深入研究提供方向。

1 单纯肝脂肪变性动物模型

1.1 高脂饮食(high fatdiet,HFD)动物模型 肝脂肪变性是NAFLD的最主要特征，是脂肪滴以甘油三酯的形式在肝细胞内堆积。NAFLD患者肝内甘油三酯来源于甘油和游离脂肪酸的酯化作用[4]，当肝细胞合成或摄入游离脂肪酸的比例超过输出或分解时，甘油三酯将在肝细胞内堆积[6]。另外，肥胖患者TNFα的过多表达可激活IκB(NF-κB抑制蛋白)激酶β，IκB激酶β通过抑制胰岛素受体底物(IRS-1/IRS-2)的磷酸化而促进IR的发展，并促进肝游离脂肪酸的堆积，进而通过酯化作用促进肝甘油三酯堆积、肝脂肪变[7]。

鉴于NAFLD与肥胖相关，HFD可诱导NAFLD模型。Lieber等[8]发现通过高脂饮食(45%～75%的食物总热量摄入来源于脂肪)可构建脂肪肝动物模型，3周后即可出现肝脂肪变和脂质聚集，并表现为IR，可测到血浆中胰岛素水平升高，但小鼠体质量无明显改变。Eccleston等[9]也报道，以HFD喂养C57BL/6鼠16周，可出现动物体质量增加，并表现出肝细胞脂肪变、气球样变、肝内甘油三酯水平增加等病理改变。同时，空腹血糖升高、脂联素的减少提示并发高血糖症及IR。Lau等[10]采用高脂饮食(45%脂肪、35%碳水化合物、20%蛋白质)喂养C57BL/6鼠12周即可出现肝细胞脂肪变性和脂质沉积。食物中能量来源配比也可影响肝脂肪变的程度：FaKhoury-Saycgh等[11]以等量(15 g·鼠-1· d-1)但不同成分(包括高脂组、中等量脂组、高蔗糖组、高果糖组)喂养Wistar鼠16周发现，高脂组鼠有最高的体质量、肝重量及最高比例的肝脂肪变(40%)。

HFD动物模型从组织病理学及发病机制两个方面模拟了与NAFLD患者类似的临床特征，包括肥胖及IR，为相应的减重、低脂饮食及改善IR治疗NAFLD提供了依据，但肝脂肪变的程度似乎还取决于其他多种因素，包括啮齿动物的种类等，这也提示不同人群对NAFLD具有不同的易感性。

基于HFD动物模型，有研究[12]发现细胞周期蛋白D3/周期蛋白依赖的激酶4是NAFLD进展过程中的一个关键因素，可能为NAFLD的治疗提供靶点。另一研究[13]发现Myricetin可减轻HFD诱导型肝脂肪变，减少肝细胞脂质堆积，增加抗氧化酶活性，可被用来治疗HFD诱导的肝脂肪变。由此可见，这种动物模型为未来NAFLD的治疗提供了方向。

1.2 db/db鼠和ob/ob鼠 瘦素可逆转IR和改善严重肝脂肪变性，降低血清甘油三酯水平，降低肝脏和肌肉组织内甘油三酯的比例，提高机体对胰岛素的敏感性。瘦素受体自身变异引起瘦素抵抗，形成高瘦素水平，又可诱发IR。由瘦素或其受体变异引起的高瘦素水平通过IR和高胰岛素血症，产生与胰岛素相关的肝内脂肪蓄积，又可通过改变胰岛素信号传导，提高肝细胞内脂肪酸的浓度，使甘油三酯的合成增加，形成脂肪肝。同时瘦素作为肝纤维化的启动因子之一，可激发肝纤维化，并促进其向肝硬化发展。

db/db鼠是糖尿病常染色体隐性基因的纯合子表型，db基因编码瘦素受体的一个突变位点，可导致瘦素信号传导缺陷[14]，因此db/db鼠体内瘦素的水平正常或升高，但作用却减弱，属于相对瘦素缺乏。瘦素的作用机制是通过促进饱感调节饮食行为，因此这些鼠出现持续的摄食过量，从而发生肥胖并伴发糖尿病[15]，继而出现严重的高血糖血症、高胰岛素血症和高瘦素水平，并发展成大泡型肝脂肪变[6，16]。在控制正常饮食情况下，db/db鼠不会自发地发展为肝炎，但长期进食过多(>1个月)将使肝脏炎症轻微加重[14]。然而，以正常量饮食喂养的db/db鼠极少表现出NASH的特征，因此db/db鼠本身只是NAFLD较好的模型，而不是NASH的有效模型，但如果用蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(methionine and choline deficient diet,MCD)和反式脂肪给予db/db鼠“二次冲击”则能诱发NASH。

ob/ob鼠携带瘦素基因中的一个常染色体隐性突变基因，不同于db/db鼠，ob/ob鼠具有功能性瘦素受体，但缺乏瘦素，属于绝对瘦素缺乏。同样，这些鼠极其超重、食欲过盛，并且有高胰素血症、高血糖血症，且对胰岛素产生抵抗，能自发地发展为肝脂肪变[14]。如果进一步在MCD、HFD、小剂量的脂多糖内毒素[17]、酒精、肝局部缺血再灌注[6]的打击下也可发生脂肪性肝炎。然而，因为瘦素是肝纤维化的启动因子，所以不同于db/db鼠，ob/ob鼠不会发展为肝纤维化。

db/db、ob/ob鼠模型的优点是其能够呈现人类代谢综合征的特点。如没有额外打击的因素(比如MCD饮食)喂养时，它们是很好的单纯肝脂肪变模型。以MCD饮食二次冲击，db/db鼠仍能用来研究脂肪变性到NASH的进展过程。但由于基因突变引起的先天瘦素缺陷和瘦素抵抗在肥胖人群中极为少见[17]，因此，在反映人类肥胖、IR和肝脂肪变方面，db/db鼠模型和ob/ob鼠模型有一定的缺陷。尽管这类鼠模型有一定的缺陷，但在db/db鼠中，羧酸酯酶2证实为新型的与甘油三酯的稳态和NAFLD相关的甘油三酯水解酶[18]，因此这类鼠模型仍为研究治疗措施提供了有利条件。

2 NASH动物模型

大约三分之一单纯脂肪变的NAFLD患者会发生NASH[19]。小叶性炎症(常在腺泡3区)和肝门区炎症是NASH的主要病理改变[20]。NASH的其他组织学损害包括肝细胞气球样变、肝纤维化、凋落小体、正胶原蛋白形成、Mallory小体、巨线粒体、糖原核、铁沉积等[21]。

目前，对脂肪变性到NASH转变过程的最好的解释是“二次打击”[22]和“多重打击”[23]假说。IR和代谢改变作为第一次打击，导致肝脂肪变性，继而在氧化应激、炎症因子、异常的肝内胆固醇沉积、高胰岛素血症、高瘦素血症、低脂联素血症等多重打击的作用下导致肝脏炎症[23]，同时基因易感性也有一定作用[24]。所有因素中，氧化应激和炎症因子被认为是关键的两种机制。

2.1 蛋氨酸和MCD模型 以MCD作为“二次打击”信号喂养小鼠可建立NASH营养模型。这种饮食包含40%能量的蔗糖和10%能量的脂肪，但是不含有蛋氨酸和胆碱。动物饮食中缺乏胆碱将损害肝内极低密度脂蛋白的分泌，导致肝脂肪变、氧化应激损伤、肝细胞死亡等[25]，一般仅导致轻微肝炎和肝纤维化。然而，以MCD饮食喂养小鼠，却会在最初的2周内导致严重的肝炎，6周后出现严重的肝纤维化[6,26]。MCD模型比其他饮食模型更能模仿人类严重的NASH的病理学改变。其模型中炎症、纤维化、肝细胞凋亡发展比以HFD模型或其他饮食喂养的鼠模型更快、更严重。MCD模型中的内质网应激、氧化应激、自我吞噬应激都比其他模型表现的更活跃[27]，因此这种饮食模型鼠能更好地模仿人类NASH发病相关的机制，所以通常被优先选择去探讨NASH的组织学进展及NASH患者炎症和纤维化的机制及治疗。Yamamoto等[28]在以MCD喂养的db/db鼠模型中，发现唾液素4改善了MCD诱导的脂肪性肝炎的生成，并减少了甘油三酯和游离脂肪酸的含量，提出唾液素4可能被用来治疗非肥胖型NASH患者。

但MCD模型也有一定的局限性，因为它与NASH患者的实际代谢状况完全不同，MCD小鼠不表现体质量过重，反而出现严重的体质量下降、恶病质、无IR,以及低血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯水平[29]。因此，以MCD喂养db/db鼠、ob/ob鼠才能更好反映NASH患者实际状况，MCD饮食的db/db鼠表现出典型的肝炎和肝纤维化[16]。另外，MCD饮食对不同种族小鼠的影响能力不同，表现为ALT升高水平不同。用缺乏蛋氨酸的饮食长期喂养小鼠，DAB/2J鼠比C57BL/6鼠出现更严重的肝损伤，甚至可出现肝癌，但C57BL/6鼠并非如此。不同小鼠ALT水平从高到低的排列是：A/J>C57BL/6 >C3H/HeH=Balb/c=DAB/2J[30]，这在一定程度上反映了个体易感性的差异。

2.2 高胆固醇饮食(high cholesterol diet,HCD)动物模型 有研究提出膳食胆固醇是动物模型[31]和人类[32]中脂肪性肝炎和炎症进展的一个重要因素。单独以HCD(1%)喂养小鼠表现出血胰岛素水平显著增加，而肝重量、血中ALT、甘油三酯和游离脂肪酸水平仅轻度增加[32]。但以高胆固醇混合高脂或高胆盐饮食喂养小鼠时，NASH的特征是显著的。以高脂(15%)和高胆固醇(1%)混合成的饮食喂养小鼠时，小鼠表现出更高的体质量增加、更多的肝脂质堆积、更明显的ALT水平升高和脂联素减少，脂肪组织炎症(高TNFα表达)和纤维化程度也更重。以上所有特征，混合饮食组比HCD组和HFD组更显著[32]。同样地，以高胆固醇(1.25%)和高胆盐(0.5%)混合饮食喂养小鼠也显示出更重的脂肪变、炎症、肝气球样变、纤维化[21]。此类研究[31-32]表明控制胆固醇饮食可减少极低密度脂蛋白合成和脂肪酸β-氧化，并减少细胞凋亡和肝脏氧化应激。

2.3 高果糖饮食模型 富含果糖的食物也与肥胖和NASH的进展相关[33]。以HFD饮食或高脂肪和高果糖混合饮食(high-fat high-fructose diet,HFHF)喂养C57BL/6鼠模型结果发现，消耗果糖是肝脂肪沉积到肝纤维化生成过程中必需的环节，因为尽管体质量增加、身体肥胖、IR、肝脂肪变程度在两组相似，但HFHF组鼠表现出更强的肝氧化应激以及肝CD11b+F4/80+Gr1+巨噬细胞数和胶原沉积增加[33]。一项最新研究[34]发现，以同样的HFHF饮食分别喂养CXCR-3基因敲除鼠和C57BL/6野生鼠，CXCR-3基因敲除鼠表现出较轻的肝组织学改变和较低水平的坏死性炎症，脂质过氧化反应也明显减低，这表明在HFHF鼠模型中CXCR-3基因在NASH进展过程中的起重要作用。

2.4 foz/foz鼠 foz/foz鼠有一个突变的Alms1基因，其在细胞内转运和食欲调节中起作用[35]。foz/foz鼠表现为病态的肥胖和食欲过盛，出现IR、脂联素水平极大减少、胆固醇增加及肝脏脂肪变。HFD通过加重代谢并发症来促进纤维化的发生，导致脂联素水平降低、胆固醇水平升高。然而，饮食诱导的NASH严重性取决于小鼠的种族。以HFD喂养的foz/fozC57BL/6J鼠和foz/fozBALB/c鼠体质量增加是相同的，但是NAFLD在foz/fozBALB/c鼠中比foz/fozC57BL/6J鼠更严重。IR、高胰岛素血症、肥胖以及显著的NAFLD相关肝纤维化可在foz/fozBALB/c鼠中被发现，而在foz/fozC57BL/6J鼠中未曾发现。这些研究结果，尽管肥胖的程度相同，但NASH的特征却和种族相关[36]。

2.5 增加铁负荷的db/db鼠模型 最新研究[37]表明db/db鼠体内超负荷的铁可促进NAFLD到NASH和纤维化的进程。与正常饮食组喂养db/db鼠不同，高铁饮食喂养的db/db鼠表现出肝细胞气球样变、纤维化形成、肝氧化应激增加、肝炎性免疫细胞活跃及肝线粒体脂肪酸β-氧化受损的改变，表明铁负荷过重可能与NASH相关。

3 NAFLD诱导的HCC模型

非肝硬化NASH发生HCC的几率是极低的[38]，脂肪摄入过多、肝脂肪变、NASH均是HCC的风险因素[5]。目前NAFLD和NASH鼠模型不能反映从脂肪肝、NASH、肝纤维化到HCC的组织学进展过程。虽然目前有很多实验性HCC小鼠模型，但只有少量能反映NAFLD诱导的HCC特点[39]，因此建立新型的NASH相关HCC的动物模型是面临的挑战。

3.1 膳食NAFLD诱导的HCC模型 单纯以一种饮食喂养的动物模型均有不同的局限性，以HFD喂养的C57BL/6鼠不能显现NASH相似的病理学改变，而以MCD或胆碱缺乏喂养的小鼠却可以，但MCD或胆碱缺乏饮食的鼠却不能诱导代谢综合征和肥胖的特征。因此Wolf等[40]提出一个混合饮食模型，即胆碱缺乏和HFD混合饮食(CD-HFD)。肝脂肪变、肝损伤、ALT、AST水平上升等改变，可同时存在于这种新型模型中。HFD鼠肿瘤发生率只有2.5%，而CD-HFD鼠肿瘤发生率可提高到25%。

在另一种联合饮食模型中，以胆碱缺乏L-氨基酸的饮食(choline-deficient L-amino acid-defined diet,CDAA)喂养的小鼠可发展为肝损伤，其能反映NASH特征，并导致HCC。以CDAA喂养小鼠可诱导小鼠IR和肝脂肪变增加，糖类和脂质代谢酶的改变，并可诱导肝损伤和纤维化，甚至喂养9个月后可发展为HCC[41]。

Asgharpour等[42]最近报道一个NAFLD的饮食诱导HCC动物模型，是由C57BL/6J鼠和129S1/SvlmK鼠产生的同基因品系(isogenic strain,B6/129)，其可以具备NASH相关HCC患者的关键特征。以高脂肪和高糖混合饮食喂养的B6/129鼠可循序在4～8周发展为脂肪变，16～24周发展为NASH，52周后发展为HCC，这种模型是NASH相关HCC的一种理想的临床前动物模型。

以CDAA饮食喂养并给予腹膜内注射CCl4的C57BL/6鼠具有更显著的NASH和HCC特征，此类鼠比单一CDAA喂养的鼠有更严重的脂肪变、肝小叶炎症和纤维化形成。此外，仅35%的CDAA C57BL/6鼠发展为HCC，但所有CDAA联合CCl4的小鼠均发展为HCC，并且肿瘤的平均直径更大[41]。

另外一种联合动物模型，是以HFD饮食喂养并进一步给予链脲霉素(streptozotocin,STZ)治疗的C57BL/6鼠，STZ是一种氨基葡萄糖亚硝基脲合成物，对胰腺β细胞有毒性作用，可在小鼠中诱导低胰岛素血症、高血糖血症和糖尿病。以HFD刺激STZ小鼠可诱导肝脏组织学改变，包括脂肪变、小叶炎症、纤维化，并在20周时出现肿瘤性突出物。其他与人类NASH类似的特征包括体质量增加、空腹血糖上升和ALT升高。雄性STZ HFD小鼠在16周时出现肝细胞大量增殖，并且最终发展为HCC。这种模型为观察代谢紊乱、NASH以及HCC的相关机制提供了方式[43]。

3.2 先天性NAFLD诱导型HCC模型 磷酸酶及张力蛋白同族体(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是一种肿瘤抑制基因，其缺乏将导致细胞过度增殖、凋亡减少、肿瘤形成。肝脏特异性PTEN缺乏鼠可进展成与人类相似的NASH和NASH相关的HCC。66%雄性和30%雌性PTEN缺乏鼠可在40～44周后在肝内出现肿瘤，83%雄性和50%雌性鼠可在74～78周后出现HCC[44]。因此，这种模型有助于理解NASH发病机制，也有助于了解NASH到HCC的发展进程。

3.3 联合基因和化学物质诱导的NAFLD相关HCC模型 先天性肥胖是db/db鼠NASH相关性HCC进展的直接促发因素。以致癌物质二乙基亚硝胺处理的小鼠在13～15 d龄时出现体重增加、肝重量增加、肝脂肪变，同时也出现更高的HCC发生率以及更多更大的肿瘤结节[45]。这也为肥胖和NASH增加HCC的易感性相关研究提供了依据。

4 结论

上述动物模型用于模拟完整的NAFLD疾病谱都有自身的限制，有些能反映NAFLD的组织病理学，但不能反映其生理性，另一些则反映其生理性，但不能反映组织病理学。尽管它们各有不足，但目前在研究NAFLD的发病机制和疾病发展过程是很好的工具，并有助于揭示潜在的治疗靶点，进一步探索更理想的、能模仿疾病谱的动物模型仍是今后研究的方向。

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Researchadvancesinanimalmodelsbasedonthepathogenesisandtreatmentofnonalcoholicfattyliverdisease

CHENYanzhen,CHENChengliang,TIANXing,etal.

(DepartmentofGastroenterology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a continuous disease spectrum characterized by the accumulation of excessive lipid in hepatocytes. Simple hepatic steatosis may progress to NAFLD and even liver fibrosis, liver cirrhosis, and finally hepatocellular carcinoma. Animal models can simulate different causes and histopathological and pathophysiological changes in each stage of NAFLD and thus provide critical guidance for understanding the pathogenesis of NAFLD and selecting therapeutic measures. At present, there are still no ideal animal models that can simulate the whole disease spectrum. This article introduces the most frequently used and recently developed animal models for NAFLD and NAFLD-induced liver cancer and summarizes possible therapeutic targets with reference to the experimental pathogenesis of NAFLD in animal models, in order to provide a basis for further research on the pathogenesis and treatment of NAFLD.

nonalcoholic fatty liver disease; model animal; review

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2457-05

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.046

2017-08-08；修回日期：2017-08-29。 作者简介：陈艳珍(1991-)，女，主要研究肝胆及胃肠疾病。 通信作者：焦健，电子信箱：zrjiaojian@163.com。

引证本文：CHEN YZ, CHEN CL, TIAN X, et al. Research advances in animal models based on the pathogenesis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2457-2461. (in Chinese)

陈艳珍， 陈成良， 田兴， 等. 基于非酒精性脂肪性肝病机制及治疗的动物模型研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(12): 2457-2461.

(本文编辑：林 姣)