新疆沙枣树叶提取物对糖尿病小鼠血糖的影响

田红林++宫海燕++冯易++沈孝云++郭童童++孙芸

摘要：用溶劑提取法制备新疆沙枣树叶的提取物，得到沙枣树叶乙酸乙酯提取物、沙枣树叶正丁醇提取物和沙枣树叶水提取物；用体外α-葡萄糖苷酶抑制模型，对3种沙枣树叶提取物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选，并与阳性对照药阿卡波糖进行比较。采用腹腔注射四氧嘧啶构建糖尿病动物模型，造模成功后，将糖尿病小鼠分为模型对照组、二甲双胍处理组、新疆沙枣树叶乙酸乙酯提取物和水提取物处理组，另设正常对照组。连续灌胃给药18 d，每天一次，采血测空腹血糖。结果表明，新疆沙枣树叶的3种提取物对α-葡萄糖苷酶的活性有较好的抑制作用，有2个提取物的抑制率明显高于阿卡波糖，其中新疆沙枣树叶乙酸乙酯提取物活性最强，在浓度为0.075 g/L时，其酶抑制率为76.62%。阿卡波糖及3种提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50分别为阿卡波糖IC50 891.38 mg/L，沙枣树叶乙酸乙酯提取物IC50 9.28 mg/L，沙枣树叶正丁醇提取物IC50 103.5 mg/L，沙枣树叶水提取物IC50 73.99 mg/L。结果显示，新疆沙枣树叶提取物对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖有降低的作用，和对照组比较有显著差异（P<0.05）。新疆沙枣树叶提取物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，对糖尿病小鼠具有降糖作用。

关键词：新疆沙枣树叶；提取物；α-葡萄糖苷酶；糖尿病小鼠

中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0103-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.026

The Effects of Extracts from Elaeagnus angustifolia L. Leaves of Xinjiang on Blood Glucose of Diabetic Mice

TIAN Hong-lin1，GONG Hai-yan2，FENG Yi3，SHEN Xiao-yun4，GUO Tong-tong4，SUN Yun4

（1. The TCM Hospital Affiliated to XinJiang Medical University，Urumqi 830000，China；2.The Fifth Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China；3.Chengdu Medical College， Chengdu 610083，China；4.School of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011， China）

Abstract： Three kinds of extracts of Xinjiang Elaeagnus angustifolia L. Leaves（EAL） including EAL ethylacetate extraction，EAL normal butyl alcohol extraction and EAL water extraction were prepared by solvent extraction. The inhibitory effects of these extracts to α-glucosidase activity were investigated by in vitro enzymatic method；and akarbose was used as positive reference substance. The diabetic model were induced by peritoneal injection of alloxan. Then the diabetic mice were divided into model control group，metformin treated group，EAL ethylacetate extraction treated groups，EAL water extraction treated groups and normal control group was another one. The drugs were chronically administrated to diabetic mice once a day for 18 days. The blood glucose（GLu） were determined. The results showed that， the extracts of EAL showed obviously inhibitory action against α-glucosidase activity in which three extracts have higher effects compared to those of acarbose，among them，the extract of EAL ethylacetate extraction was more effective for enzyme inhibition with a inhibitory rate of 76.62%. The EAL IC50 of the three extracts were：Acarbose IC50 891.38 mg/L，EAL ethylacetate extraction IC50 9.28 mg/L，EAL normal butyl alcohol extraction IC50 103.5 mg/L and EAL water extraction IC50 73.99 mg/L. The result indicate that EAL extraction has the effect which can lower the level of blood sugar of tetroxide pyrimidine diabetes mice，comparing with control group，the difference is obviously（P<0.05）. Xinjiang E. angustifolia L. Leaves extracts had remarkable inhibitory effect to α-glucosidase activity. The EAL can decrease the blood glucose.

Key words： Xinjiang Elaeagnus angustifoliaon L. leafs；extract；α-glucosidase；diabetes mellitus mice

沙枣（Elaeagnus angustifolia L.）属胡颓子科植物，维药名为吉嘎旦，具有健脾胃、止泻涩肠的作用[1]。沙枣在新疆是防风林主要植物，具有较高的经济价值。沙枣叶中含有多种黄酮类化合物、阿魏酸等大量有机酸，鞣质等[2，3]。有文献报道[4]，沙枣树叶总黄酮提取物对慢性气管炎、腹泻和菌痢、冠心病、心律失常等有治疗作用。

糖尿病是威胁人类健康的第三大疾病，因此研究天然降血糖活性成分用以开发降血糖药物甚至功能食品具有重要意义。本课题组在前期研究中发现，新疆沙枣树叶的总黄酮含量为（18.75±0.1106） mg/g，明显高于沙枣树枝和果实[5]。为此，制备新疆沙枣树叶的不同极性提取物，采用体内外试验观察其对血糖的影响，以期为新疆沙枣树叶的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆沙枣树叶：2015年6月采摘于新疆乌鲁木齐市，于阴凉处晾干。经新疆医科大学徐海燕副教授鉴定为胡颓子科（Elaeagnaceae）胡颓子属（Elaeagnus）坚果沙枣的干燥树叶。阴干，密封保存。

试剂：α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，G5003-100UN，美国Sigma公司）；4-硝基苯-d-D-吡喃葡萄糖苷（4-N—trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516，美国Sigma公司）；阿卡波糖水合物（Acarbose，A129816-1g，德国拜耳公司）；二甲基亚砜（DMSO），四氧嘧啶Alloxan（美国Sigma公司）；盐酸二甲双胍片（北京京丰制药有限公司，生产批号：130114）。小鼠血糖（blood glucose）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒（批号DGE30814，武汉基因美生物科技有限公司）。其他试剂均为国产分析纯。

仪器：RE-52A旋转蒸发仪；循环水式真空泵；Coda全自动酶标仪（法国Bio-Rad公司）；H13221型pH计（HANNA）；Exceed-cd-16型纯水仪（台湾艾柯）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；96微孔板。LNBROREB型电子天平（日本岛津公司生产）；AUTOTEC-120型离心机（意大利COBA公司生产）；粤制00000348大鼠称（中山市衡新电子有限公司生产）；ZF-型紫外分析仪（上海顾村电子仪器厂生产）；血糖仪（强生稳豪倍易型）。

动物：KM小鼠100只，雌雄各半，体重（20±2） g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备 称取干燥的新疆沙枣树叶50 g，分别按以下提取流程制备提取物：沙枣树叶用石油醚脱脂后，其滤渣依次用乙酸乙酯和正丁醇索氏提取、水回流提取，过滤减压浓缩，干燥，得到沙枣树叶乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物，备用。

1.2.2 新疆沙枣树叶提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用[6]

1）相关溶液的配制[7，8]。

0.1 mmol/L磷酸鹽缓冲液（PBS）：KH2PO4 4.599 g，K2HPO4·3H2O 7.646 g，用蒸馏水定容至500 mL，调节pH至6.8。

酶溶液：用0.1 mmol/L的PBS配制成0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液。

底物溶液：用0.1 mmol/L的PBS配制成2.5 mmol/L PNPG溶液。

终止溶液（0.2 mol/L Na2CO3溶液）：Na2CO3 2.119 8 g定容至100 mL。

2）α-葡萄糖苷酶活力测定与标准曲线的制作。酶活力测定：在96微孔板上进行，反应体系参照文献[9]的方法，112 μL磷酸盐缓冲液（pH 6.8），加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，DMSO 8 μL，37 ℃恒温15 min后加入2.5 mmol/L PNPG 溶液20 μL，37 ℃恒温反应15 min。再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL，于405 nm波长下测A值。

酶活力单位定义：37 ℃，pH 6.8条件下，每1 min水解底物产生1 μmol/L对硝基苯酚的酶量，定义为1个酶活力单位（U）。

标准曲线制作根据采用的反应体系，用磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配制1 000 μmol/L PNP，稀释成400、300、200、150、100、50、0 μmol/L。分别取7种不同浓度的PNP溶液各160 μL，加入0.2 mol/L Na2CO3的水溶液80 μL混匀，在405 nm下测定A值，测6组取平均值。以A为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，得标准曲线。

3）测定α-葡萄糖苷酶抑制活性的反应体系方法[10]。抑制剂活力单位定义为：pH 6.8，37 ℃时使一个酶活力单位失活为一个抑制剂活力单位。

抑制率=（抑制剂活力/酶活力）×100%

测定组：将pH 6.8的磷酸盐缓冲液112 μL，加入0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，抑制剂8 μL（待测目标产物）溶液，在37 ℃下保温15 min。加入20 μL PNPG溶液，在37℃下保温15 min后，再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液，水溶液80 μL，于405 nm波长下测A值，为Ati（表1）。

体系空白组：相对于测定组不加抑制剂和α-葡萄糖苷酶，用蒸馏水作空白，为Ab。

未加抑制剂测试组：相对于测定组不加抑制剂，为Ato。

未加酶空白组：相对于测定组不加α-葡萄糖苷酶，为Abi。

按下式计算目标化合物（抑制剂）对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

抑制率=（△A-△AEi）/△A×100%

式中，△A=未加酶抑制剂与底物反应后的吸光度变化值（Ato-Ab）；△AEi=加入酶抑制剂后与底物反应后的吸光度变化值（Ati-Abi）。

4）新疆沙枣树叶提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。按照上述方法，测定新疆沙枣树叶3种提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

1.2.3 对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影响[11-13]

1）糖尿病小鼠模型的制备。取健康KM小鼠100只，18～20 g，雌雄各半，先适应性喂养1周，禁食不禁水12 h，将四氧嘧啶用生理盐水配制成2%浓度，按照220 mg/kg剂量分3次腹腔注射。3 d后测定血糖，选择血糖在11.4～20.0 mmol/L的定为高血糖造模成功组。

2）新疆沙枣树叶提取物对四氧嘧啶致糖尿病小鼠空腹血糖的影响。取造模成功KM小鼠50只，分为空白组、模型组、阳性药对照组、沙枣树叶水提取物组、沙枣树叶乙酸乙酯提取物组，共5组，阳性对照组、新疆沙枣树叶水提取物组和乙酸乙酯提取物组分别灌喂盐酸二甲双胍片、新疆沙枣树叶水提取物和乙酸乙酯提取物的0.5% CMC-Na溶液。空白组和模型对照组给予蒸馏水。每日给药1次，连续给药18 d。末次给药前禁食不禁水12 h，末次给药后2 h，眼眶取血，采用酶联免疫分析（ELISA）试剂盒测定小鼠空腹血糖。

3）数据分析。计量资料用SPSS 17.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 新疆沙枣树叶提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.1.1 α-葡萄糖苷酶活力测定与标准曲线的制作 以A为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，得标准曲线：y=0.006 9x+0.019 2（r=0.999 8）。

2.1.2 新疆沙枣树叶提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 试验结果见表2。从表2可知，新疆沙枣树叶3种提取物及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的活性均有抑制作用。其中沙枣树叶乙酸乙酯提取物的抑制率最高可达76.62%。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着浓度的增加呈上升趋势，存在比较好的量效关系。当正丁醇提取物的浓度低于0.10 g/L时，乙酸乙酯提取物浓度低于0.005 0 g/L时，其抑制率变为负值，即可能在浓度比较低时，沙枣树叶正丁醇提取物和沙枣树叶乙酸乙酯提取物的抑制作用转化为促进作用。

2.2 新疆沙枣树叶提取物对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影响

2.2.1 行为学观察 KM小鼠腹腔注射3次四氧嘧啶后，出现明显的多饮、多食、多尿等现象，测定空腹血糖值明显高于正常值，说明造模成功。

2.2.2 新疆沙枣树叶提取物对四氧嘧啶致糖尿病小鼠空腹血糖的影响 试验结果见表3。由表3可知，与模型对照组相比，空白对照组有极显著差异（P<0.01）；阳性对照组可极显著降低小鼠血糖浓度（P<0.01）；沙枣树叶水提取物组和乙酸乙酯提取物组均可显著降低小鼠血糖浓度（P<0.05）。

3 小结

新疆沙枣是具有广阔应用前景和研究价值的品种。由于本试验的新疆沙枣树叶提取物中含有大量的脂溶性成分，因此采用DMSO进行溶解，经试验确定，当DMSO所占反应体系的体积百分数小于1%时不会对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用。

α-葡萄糖苷酶活力随溫度、pH改变会有较大变化，且不同批次之间也有差异，因此试验前应先测定酶活力。

四氧嘧啶所致糖尿病小鼠造模过程中，发现使用含有4个结晶水的四氧嘧啶，小鼠血糖始终无法达到糖尿病的造模要求。在连续造模两次失败之后，改用含有1个结晶水的四氧嘧啶，其造模效果与文献报道一致[11]。

参考文献：

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