柯萨奇病毒B组4型河南分离株VP1区基因特征分析

许玉玲 王海霞 卫海燕 黄学勇

450016 郑州，河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所 河南省传染病病原生物重点实验室

人类肠道病毒B组的柯萨奇B4病毒(CoxB4)感染机体后，可以导致无临床症状的隐性感染，也可引起多种临床疾病，如手足口病、脑膜炎、咽峡炎、发热出疹性疾病、儿童多动症(ADHD)、胰腺炎和儿童I型糖尿病等。2013年从河南手足口病监测网络分离出8株该病毒，对其进行VP1区扩增，分析序列特征，并与其他疾病CoxB4分离株进行VP1区基因特征分析，查找可能与致病机制相关的基因特征，为手足口病的深入研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1样本来源粪便标本来自2013年河南省各地市疾病预防控制中心和医院的手足口患儿，-70 ℃ 保存备用。

1.2实时荧光检测按照手足口病实验室检测方案，对粪便进行前处理，离心后取上清200 μl，用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA。江苏硕士有限公司的单通道EV71、CA16和肠道通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测标本。反应体系为25 μl： RT-PCR反应液7.5 μl，相应反应液4 μl，酶混合液5 μl，纯水3.5 μl，模板RNA 5 μl，充分混匀，6 000×g离心60 s，使用BIORAD- iQ5仪器进行实时RT-PCR检测。扩增程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 5 min； 95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s(收集荧光)，45个循环，实验设置阴性和阳性对照，结合Ct值和扩增曲线判读结果。

1.3病毒分离和鉴定将肠道通用检测阳性的标本，每份选择200 μl接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma, RD) 和人喉癌上皮细胞(human laryngeal carcinoma, HEp-2)，置于5%CO2、36 ℃培养箱，连续培养3～7 d，每天观察记录细胞变化，每个标本传2代，若均没有出现致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，则判为阴性，只要一种细胞出现了肠道病毒特异CPE，则在CPE达到 +++时收获细胞，并提取病毒RNA。……