LINGO-1在脊髓神经干细胞向少突胶质细胞分化中的作用研究

赵晨光，许刚，琚芬，孙玮，袁华，牟翔

LRR结构和免疫球蛋白结构域Nogo受体作用蛋白(LRR and Ig Domain Containing，Nogo Receptor Interacting Protein，LINGO-1)是髓鞘源性抑制因子(Myelin-Associated Inhibitory Factors，MAIFs)复合受体中最为重要的组成部分之一[1]。当脊髓损伤后，Nogo-A、髓磷脂相关糖蛋白(Myelin Associated Glycoprotein，MAG)等髓鞘源性抑制因子大量释放，并通过与NgR/P75/LINGO-1或NgR/P75/LINGO-1复合受体结合来介导多种生物效应，在脊髓损伤后的神经修复中扮演了极其重要的角色[2]。LINGO-1是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白，由15号染色体编码而成，定位于15q24.3，其可以通过调控RhoA途径，终使生长锥塌陷而使轴突再生受阻[3]；也可以参与并下调表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，从而影响Akt通路而调控神经元存活[4]。瑞典Frisen小组研究证实在小鼠室管膜区存在着“静止”状态的神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)，在脊髓损伤等特定因素下被激活从而出现增殖进而分化的现象[5]，本研究旨在观察LINGO-1调控脊髓神经干细胞(Spinal Cord Derived Neural Stem Cells，SpNSCs)向少突胶质细胞分化及成熟的生物学作用，为进一步调控其促进脊髓损伤后神经修复带来新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 试验用Fisher344(10周龄)大鼠(160～180g)由第四军医大学实验动物中心提供，共3只，进行3次生物学试验重复。细胞培养用DMEM/F12、B27添加剂、N2添加剂、GlutaMAX添加剂及胎牛血清等均为Gibco公司产品；bFGF和EGF购于Peprotech公司，Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin购于Sigma公司；LINGO-1、A2B5、O4、髓鞘碱性蛋白(Anti-Myelin Basic Protein，MBP)，荧光二抗FITC-conjugated Goat anti-mouse，FITC-conjugated Goat anti-rabbit及Texas Red-conjugated Goat anti-mouse IgG购自STEMCELL公司。

1.2 方法 ①成年大鼠SpNSCs的分离培养：生长10周Fischer344大鼠处死后，椎板减压暴露脊髓，取C3至T12节段脊髓置于预冷的Hanks液中，小心用眼科剪剥离硬脊膜，将脊髓剪碎后加入Accutase中于37°C中消化30 min，加入NSCs培养基终止消化，离心后用NSCs培养基重悬，用火焰抛光的巴斯德……