母乳成分在-80℃保存过程中的稳定性研究

方芳，李婷，司徒文佑，云战友

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010110）

母乳成分在-80℃保存过程中的稳定性研究

方芳，李婷，司徒文佑，云战友

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特010110）

通过对母乳脂肪酸、维生素、活性成分以及pH值和酸度在超低温冷冻条件下的稳定性研究，最终制定伊利母乳研究实物库的母乳质量标准，以确保伊利母乳研究实物库中的母乳样本在-80℃保存过程中营养成分的损失率最小。试验结果表明，母乳在-80℃冷冻保存12个月的过程中，随着保存时间的延长，维生素含量显著降低，脂肪酸、核苷酸含量以及pH值和酸度没有发生显著性变化。母乳-80℃保存3个月时，VB2和VA的含量分别减少为新鲜母乳的35%和29%，VC含量无法检出；-80℃保存12个月时，烟酸含量减少为新鲜母乳的69%。因此，从现有检测指标来看，母乳库的质量标准应根据分析研究的母乳成分而定，若分析稳定性较差的营养成分如维生素尽量使用新鲜母乳。

母乳；成分；稳定性

2010年伊利集团建立了母乳研究实物库，并制定了母乳实物库管理规程，但母乳实物库管理规程的建立主要是参考中英文文献[1-3]，而文献中的母乳库是为了给没有母乳喂养的婴儿提供母乳的资源库[4-5]，与我们建立的母乳实物库进行母乳成分研究的目的不同。因此，文献中母乳库管理规程在我们实际应用时应通过大量的试验加以修改，以保证母乳各营养成分在保存和试验研究过程中，其含量不发生变化，确保母乳研究的准确性，最终达到伊利母乳研究实物库的正常运行，保证在母乳研究时随用随取。因此，本文通过对母乳在-80℃保存过程中维生素和活性成分分析，了解母乳在超低温冷冻过程中母乳成分含量的变化特点，针对不同的母乳营养成分，选择不同保存时间的母乳进行研究，为制定伊利母乳研究实物库的母乳质量标准奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳成熟乳（产后30 d～60 d）1 450mL；VA、VE标准储备液（视黄醇）、VC标准溶液、VB1、VB2、VB3标准储备液、脂肪酸甘油三酯标准品：购自Sigma公司；乙醇、无水硫酸钠、氢氧化钾水溶液、石油醚、正丁醇、盐酸、铁氰化钾、三水乙酸钠、冰乙酸、混合酶溶液、盐酸、氢氧化钠、异丙醇、高氯醇、庚烷硫酸钠、乙酰氯、乙酰氯甲醇溶液、碳酸钠溶液等试剂均为分析纯；无水碳酸钠甲苯为色谱纯；50mL离心管。

1.2 仪器与设备

Waters1525高效液相色谱仪：上海魁元科学仪器有限公司；RE-2000A旋转蒸发器：西安予辉仪器有限公司；UV-6000紫外分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；D3024R台式高速冷冻型微量离心机离心机：呼和浩特市华拓仪器设备有限公司；AL204电子天平、Seven Excellence pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；THD-05恒温热水浴槽：宁波天恒仪器厂；Agilent7890A气相色谱仪：安捷伦科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳样本的采集及处理

选取呼市地区足月分娩的健康产妇10人，进行母乳成熟乳（产后30 d～60 d）的采集，每个产妇的母乳采集量为145mL，冷藏运送至实验室，母乳混合均匀后，按照所需样本量进行分装，所有样本在采集或室温冻融后2 h内检测，检测前将样本混匀。

1.3.2 母乳成分含量测定

母乳VA、VE的检测方法参考De Ruyter MG[6]和 SpeekAJ等[7]的高效液相色谱法进行检测，母乳VB1、VB2、VB3的检测方法参考Zafra-Gómez等[8]的高效液相色谱法进行检测。母乳VC的检测方法参考SpeekAJ[9]等的高效液相色谱法进行检测。母乳脂肪酸的检测方法参考Daxi Ren等[10-11]的高效液相色谱法进行检测。母乳酸度和pH值的测定方法参考中华人民共和国国家标准GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》方法[12]进行检测。

2 结果与分析

2.1 母乳脂肪酸在-80℃保存过程中的含量变化

母乳脂肪酸在-80℃保存过程中的含量变化见表1。

表1 母乳脂肪酸在-80℃保存过程中的含量变化Table1 Variation of fatty acid concentration in human milk during storage at-80℃for 12months

由表1的数据可以看出，母乳在-80℃保存12个月的过程中，饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的含量没有显著性差异。同时母乳中的各种不饱和脂肪酸含量（包括DHA、ARA、亚油酸、亚麻酸）在-80℃保存12个月的过程中均没有显著性变化，饱和脂肪酸中只有C12：0，C13：0和C10：0在-80℃保存12个月过程中有显著性差异，其他饱和脂肪酸均未发生变化。母乳中的C12：0在保存12个月时，其含量显著低于新鲜母乳及保存6个月和9个月的母乳含量；母乳中的C13：0和C10：0在保存12个月时，其含量显著高于新鲜母乳及保存6个月和9个月的母乳含量。随着保存时间的延长，母乳中一些脂肪酸含量增加，可能由于母乳中存在脂肪酶[13-17]，脂肪酶在超低温冷冻保存过程中仍然有活性，因此脂肪会在脂肪酶的作用下将其分解为脂肪酸，导致脂肪酸含量的增加。本研究结果与其他文献报道的结果较一致，M. Romeu-Nadal等[18]研究表明，母乳在-80℃保存12个月，DHA、ARA、亚油酸、亚麻酸、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、n-3和n-6多不饱和脂肪酸的含量与新鲜母乳中的含量没有显著差异。

2.2 母乳维生素在-80℃保存过程中的含量变化

母乳维生素在-80℃保存过程中的含量变化见表2。

表2 母乳各种维生素在-80℃保存过程中的含量变化Table2 Variation of vitamins concentration in breast milk during-80℃storage of human milk

从表2可知，母乳在-80℃保存3个月时，VB2和VA的含量发生了显著性的变化。母乳保存3个月时，VB2和VA含量减少为新鲜母乳的35%和29%，但3个月后，随着母乳保存时间的延长，VB2和VA的含量没有发生显著性变化，只是含量略有减少。从目前现有国内外文献查询中，没有找到有关母乳冷冻保存对母乳VB2和VA含量的影响。因此以上实验数据证明，母乳中VB2和VA在保存过程中很不稳定，即使超低温冷冻，也对其含量有较大损失。

母乳在-80℃保存过程中，VE含量呈现出逐渐减少的趋势，但在保存12个月的过程中，其含量没有发生显著性变化。这与M.Romeu-Nadal[18]和Ramón Lacomba[19]等的研究结果一致，M.Romeu-Nadal等研究发现，母乳-80℃保存12个月α-生育酚和γ-生育酚的含量没有改变。Moffatt等[20]同样验证了母乳-70℃保存16周，母乳中α-生育酚的含量与新鲜母乳相比没有显著变化。由此可知，母乳中VE含量在冷冻保存过程中非常稳定，不会发生显著性变化。

母乳在-80℃保存9个月过程中，烟酸含量没有发生显著性变化，但是保存12个月时，其含量减少为新鲜母乳时的69%。从目前现有国内外文献查询中，没有找到有关母乳-80℃冷冻保存对烟酸含量的影响。仅查到Beverly等研究[21]证明了母乳在-25℃保存3个月，生物素、烟酸、泛酸含量与新鲜母乳无显著性差异。

母乳中VC含量较低，有的母乳在新鲜时甚至就无法检出。同时，由于VC含量容易受到光照、氧化的影响，因此母乳在保存时应该格外注意。本次试验发现，母乳保存3个月后，其含量便无法检出。本研究结果与文献结果不一致。M.Romeu-Nadal等[18]将母乳-80℃保存8个月，VC含量与新鲜母乳没有显著差异；-80℃保存12个月，VC含量下降了12%。本试验结果与M.Romeu-Nadal的结果不同，可能由于本试验母乳的VC含量较低引起，因此微小的变化就会引起显著的差异。

2.3 母乳活性成分核苷酸在-80℃保存过程中的含量变化

母乳活性成分核苷酸在-80℃保存过程中的含量变化见表3。

由表3可以看出，母乳核苷酸总量及每一种核苷酸分量在-80℃保存过程中，其含量没有发生显著性变化。从趋势上来看，核苷酸总量及其分量略有上涨趋势，可能是由于母乳中存在核酸酶，冷冻状态下核酸酶的活性较低，会少量的将寡聚核苷酸分解为核苷酸单体，造成每一种核苷酸含量的增加，导致核苷酸总量在保存12个月时有所增加。但这种变化不会引起样本的显著性差异，因为核酸酶只有在0℃以上，其活性才会大大增强。

表3 母乳核苷酸在-80℃保存过程中的含量变化Table3 Variation of nucleotide concentration in breast milk during-80℃storage of human milk

2.4 母乳酸度、pH值在-80℃保存过程中的含量变化

母乳酸度、pH值在-80℃保存过程中的含量变化见表4。

表4 母乳酸度和pH值在-80℃保存过程中的变化Table4 Variation of acidity and pH in breast milk during-80℃storage of human milk

由表4可以看出，母乳在-80℃，12个月的保存过程中酸度和pH值没有发生显著性变化。但是总体上，随着母乳保存时间的延长，母乳酸度有所增加，而pH值没有（增加或减少）的变化趋势。文献中没有查到利用母乳酸度进行超低温冷冻保存的稳定性研究实验。查到的文献中，我国谢恩萍等[22]在上海儿童医学中心采集30例新鲜母乳，分别在0h（室温）、48h（4℃）、72 h（4℃）、30 d（-20℃）、90 d（-70℃）进行了pH值跟踪监测，发现新鲜母乳与-70℃保存90 d的母乳相比，pH值变化具有显著差异性，但是-70℃保存90 d的母乳仍没有发生变质，婴儿可以食用。

3 结论

本研究对母乳在-80℃冷冻保存12个月的过程中的脂肪酸、维生素、活性成分以及pH值和酸度的变化进行了研究。研究发现，母乳在-80℃冷冻保存12个月的过程中，随着保存时间的延长，维生素含量显著降低，脂肪酸、核苷酸含量以及pH值和酸度没有发生显著性变化。因此该研究通过分析母乳易发生质量变化的成分或指标在-80℃不同保存时间的变化情况，找出了母乳中易变质成分在-80℃保存过程中的变化规律，我们今后将继续进行母乳其他成分及活性成分在超低温条件下的保存研究，结合文献资料，最终综合考虑，确定伊利母乳研究实物库母乳质量标准，健全伊利母乳库管理规程。

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Study on the Stability of Human Milk Components during-80℃Storage

FANG Fang，LI Ting，Mau Yau Szeto，YUN Zhan-you
（Inner Mongolia Yili Industrial Group Co.，Ltd.，Hohhot010110，Inner Mongolia，China）

Based on the stability study of human milk vitamins and activity components in cryogenic freezing conditions，the quality standards of Yili Human Milk Physical Library were made to ensure the minimum loss of nutrients of the human milk samples stored in Yili Human Milk Physical Library at-80℃.The results showed that freezing at-80℃for 12months significantly reduced vitamins contents，did not significantly change fatty acid contents nucleotide contents and pH or acidity，compared with fresh milk.VB2and VAlevels were reduced to35% and 29%of fresh breast milk respectively at-80℃for3months，and VCwas not detected；nicotinic acid was reduced to69%of fresh breast milk at-80℃for12months.Therefore，from the existing test indicators，the quality standards of human milk freezing storage should be based on human milk composition analysed，if stable nutritional ingredients such as fatty acids can be used to store human milk at-80℃for 12months.

human milk；components；stability

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.002

2016-06-06

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD18B03）

方芳（1981—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：乳品营养。