基于指标成分与近红外光谱对宁夏野生和栽培甘草的比较鉴别研究

狄天云+高晓娟+张霞+赵建军+雍婧姣+马玲+王英华+王汉卿

[摘要]比较宁夏乌拉尔甘草（以下均简称甘草）中基于指标成分含量的色谱鉴别和基于近红外光谱的光谱鉴别差异，建立快速有效鉴别宁夏野生和栽培甘草的方法。采用HPLC和紫外光谱法测定9批野生甘草和14批栽培甘草中甘草苷、甘草酸和总黄酮的含量并采集其近红外光谱信息。结果显示，基于指标成分定量的色谱鉴别无法有效鉴别宁夏野生和栽培甘草，近红外光谱结合聚类分析和主成分分析能够直观、快速、有效鉴别宁夏野生和栽培甘草样品，为甘草生长方式的鉴别及应用研究提供有效方法。同时，为甘草的品种、产地及规格等方面的鉴别提供了研究思路。

[关键词]甘草； 近红外； 指标成分； 聚类分析； 主成分分析； 鉴别

[Abstract]This study is to construct a rapid and effective method for identification of wild and cultivated Glycyrrhiza uralensis （hereinafter referred to as Glycyrrhizae Radix et Rhizoma） from Ningxia by comparison of the difference in chromatography identification based on index components and near-infrared spectroscopy identification. HPLC and UV methods were used to determine the content of liquiritin， glycyrrhizate and total flavonoids for 9 wild Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and 14 cultivated Glycyrrhizae Radix et Rhizoma samples，and the near-infrared spectroscopy was also，collected. The results illustrated that the chromatography identification based on index components could not identify wild and cultivated Glycyrrhizae Radix et Rhizoma from Ningxia， while near-infrared spectroscopy could quickly and effectively achieve it. It provides an effective method for the growth pattern identification and application of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma.

[Key words]Glycyrrhiza uralensis （Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）； near-infrared spectroscopy； index components； cluster analysis； principal components analysis； identification

甘草Glycyrrhizae Radix et Rhizoma為豆科植物甘草（又称乌拉尔甘草）Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草G.inflata Batal.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根茎^[1]，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功，素有“十方九草”之称。在我国，甘草分布范围最广，主要分布在西北、东北和华北地区，以中西部地区（内蒙古、宁夏和甘肃）所产的西甘草而闻名^[2]。甘草作为药材、食品及烟草添加品，其市场需求量急剧增加，野生资源过度采挖^[3]，蕴藏量不足50万t^[2]，被列入《国家重点保护野生药材物种名录》二级保护野生药材，2000年国务院发布的《关于禁止采集和销售发菜。制止滥挖甘草和麻黄草有关问题的通知》明令禁止对甘草的掠夺性采挖。目前，市售甘草以人工栽培为主。但是由于栽培与野生药材之间存在质量差异^[2，4]，对二者进行鉴定区分，有利于合理使用以提高临床疗效。

中药鉴定旨在研究中药的品种、质量，保证临床疗效。目前，对于中药鉴定研究除传统的基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别外，以指纹图谱研究较多^[5]，其次，分子鉴定也已逐步开展^[6]。指纹图谱虽然可以反映药材的内在质量，但是需要考虑产地、采收期等因素对化学成分的影响，且需要对药材进行前处理；分子鉴定专属性强，但是其操作复杂，且成本高^[7]。近红外光谱作为一种快速、价廉、无损分析方法，其与化学计量学结合，已被用于农业、食品、化学和石油化工等领域的定性和定量分析^[8-9]，已被欧美药典纳入附录内容^[10-11]。近红外光谱分析技术在中药材真伪、掺伪、产地、同属中药品种和中成药的鉴定及含量测定等方面已有相关研究报道，但是关于其对不同生长方式（野生和栽培）的鉴定研究报道鲜少。

本研究采用近红外光谱技术建立宁夏14批栽培甘草和9批野生甘草的近红外光谱，并对光谱采用不同的预处理方法预处理后进行聚类分析和主成分分析。同时，采用HPLC及紫外光谱法对各批甘草中指标成分甘草苷、甘草酸和总黄酮进行测定，并对其含量进行聚类分析。对近红外分析结果和指标成分含量分析结果进行比较研究，进而确定宁夏野生和栽培甘草的鉴定方法。

1 材料

1.1 仪器

Bruker Matrix-F型傅利叶变换近红外光谱仪（测试条件：分辨率8 cm^-1；样品累积扫描次数32 Scans；背景累积扫描次数

32 Scans；光谱范围12 000～4 000 cm^-1；软件为OPUS 5.5）；高效液相色谱仪（Agilent 1260 LC色谱工作站，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1311A四元泵，G1379A脱气机，GB15B二极管阵列检测器）；岛津UV1901紫外分光光度计；梅特勒XS-205电子分析天平。

1.2 试剂

甘草苷、甘草酸对照品（批号111610-201106，110731-201418）、芦丁对照品（批号100080-200707）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

实验所用的23批甘草药材采自宁夏不同产区，栽培甘草生长年限3年，经王英华主任药师鉴定为豆科植物甘草G. uralensis，样本信息见表1。

2 方法

2.1 近红外光谱测定

分别取甘草药材粉末适量，在Bruker Matrix-F型傅利叶变换近红外光谱仪扫描近红外光谱，测试条件：分辨率8 cm^-1；样品累积扫描次数32Scans；背景累积扫描次数32 Scans；光谱范围12 000～4 000 cm^-1；软件为OPUS 5.5。每个样品平行测定6次，取平均值作为该样品的原始光谱，环境条件为：温度23 ℃，湿度40%。

2.2 甘草指标成分检测

2.2.1 甘草苷、甘草酸的含量测定 按照《中国药典》2015年版一部甘草【含量测定】项下甘草苷、甘草酸的測定方法测定。

2.2.2 总黄酮的含量测定 参考文献测定总黄酮含量^[12]。

2.3 数据分析

2.3.1 近红外光谱数据预处理 采用OPUS5.5软件对各批次甘草近红外光谱分别进行矢量归一化、一阶导数、二阶导数、一阶导数+矢量归一化和二阶导数+矢量归一化预处理，导出各近红外光谱点数据。

2.3.3 聚类分析 采用R语言3.2.3对甘草近红外光谱预处理后的数据及指标成分含量数据分别进行进行聚类分析。

2.3.4 主成分分析 采用SIMCA13.0对甘草近红外光谱预处理后的数据及指标成分含量数据进行主成分分析。

3 结果与讨论

3.1 近红外分析结果

3.1.1 近红外光谱图预处理 近红外光谱常受到光程、样品厚度、基线漂移等因素的影响，在分析之前需要对其进行预处理。矢量归一化可以消除光程或样品厚度的影响，而导数化可以消除基线漂移等因素的影响。本研究将测得的近红外光谱数据导入OPUS5.5软件中获得23批甘草样本的近红外光谱图见图1。所有测得的近红外光谱分别采用矢量归一化、一阶导数、一阶导数+矢量归一化、二阶导数、二阶导数+矢量归一化预处理方法进行预处理后，经离差平方和法聚类和主成分分析，能够区分野生和栽培甘草的聚类正确率及第一主成分贡献率见表2。由表2可知，采用一阶导数+矢量归一化预处理方式对23批甘草近红外光谱进行预处理后，离差平方和聚类分析可以完全将野生和栽培甘草进行分类，第一主成分的贡献率达到99.1%，故采用一阶导数+矢量归一化方法对所得近红外光谱进行预处理，预处理后光谱图见图2。

3.1.2 近红外光谱聚类分析 聚类分析通过计算样品间的统计量（距离或相关系数等），逐步将相关性最大的样品聚在一起，直到所有样品归为一类^[13]。本研究将一阶导数+矢量归一化预处理后的近红外数据基于欧式距离采用7种聚类方法（最长聚类法、最短距离法、中间距离法、类平均法、重心法、离差平方和法和Mcquitty相似法）进行聚类，聚类结果显示，只有离差平方和法聚类结果可以完全将野生和栽培甘草进行分类，见图3，最长距离法和Mcquitty相似法的聚类正确率为91.3%，类平均法的聚类正确率69.6%，最短距离法、重心法和中间距离法聚类正确率仅为65.2%。这与各聚类方法计算距离的公式相关。聚类的目的是使类内差异较小，而类间差异较大；聚类结果中各类包含元素即不太多，也不太少^[14]。本研究采用不同的聚类方法聚类后显示，离差平方和聚类法在分析野生和栽培甘草近红外光谱时能够达到聚类的目的，效果最好，可以100%将野生和栽培甘草进行分类，表明甘草近红外光谱经适当的预处理方法后采用适当的聚类分析方法可以有效区分野生和栽培甘草。

3.1.3 近红外光谱主成分分析 将甘草近红外光谱经一阶导数+矢量归一化预处理后的数据导入SIMCA13.0软件进行主成分分析。第一主成分代表了总变异的99.1%，为甘草近红外光谱最重要的信息，第一主成分和第二主成分的累计贡献率为99.6%，仅有0.4%的信息丢失，能够反映近红外光谱的大量信息。近红外光谱主成分的载荷图见图4。由图4可知，野生甘草聚为一簇，栽培甘草聚为一簇，说明野生和栽培甘草样品具有差异，表明甘草近红外光谱经适当的预处理后经主成分分析能够有效区分野生和栽培甘草，与聚类结果一致。

3.2 各指标成分含量分析

3.2.1 各指标成分含量测定 23批甘草样品中甘草苷、甘草酸和总黄酮的含量测定数据见表1。由表1可得，各批次甘草中甘草苷和甘草酸的含量均高于药典标准，为合格药材；总黄酮含量均高于3.0%。

3.2.2 3种指标成分聚类分析 3种指标成分基于欧式距离采用7种聚类方法进行聚类，共得到两种聚类结果，均不能将野生和栽培甘草进行分类。离差平法和聚类结果见图5。

3.2.3 3种指标成分主成分分析 23批甘草样本中3种指标成分的含量主成分分析结果见图6。由图6可知，第一主成分涵盖了总变异的93.7%，将所有甘草样本分为2类，N22C为一类，其余样本为另外一类，同样不能将野生和栽培甘草分类，与聚类结果一致。

4 讨论

近红外光谱结合聚类分析和主成分分析对23批甘草药材进行鉴别分析，运用OPUS5.5软件对光谱进行6种不同预处理后，采用R语言3.2.3和SIMCA13.0分别进行聚类分析和主成分分析，根据野生和栽培聚类正确率和第一主成分贡献率筛选甘草近红外光谱最佳预处理方式，结果显示甘草近红外光谱经一阶导数+矢量归一化预处理后野生和栽培聚类正确率为100%，第一主成分贡献率高达99.1%，能够反映样品的主要信息。近红外光谱经一阶导数+矢量归一化预处理后基于欧式距离的离差平方和聚类结果显示野生和栽培甘草分别聚为两类，可以通过聚类分析将二者进行区分。主成分分析的载荷图表明甘草近红外光谱通过适当的预处理后经主成分分析能够有效区分野生和栽培甘草。

采用HPLC对23批甘草药材中甘草苷和甘草酸含量进行测定，结果显示23批甘草药材均符合药典标准，为合格药材。基于3种指标成分（甘草苷、甘草酸和总黄酮）的含量数据，采用欧氏距离的7种聚类方法（最长距离法、最短距离法、中间距离法、类平均法、重心法、离差平方和法、Mcquitty相似法）进行2聚类，聚类结果说明该3种指标成分不能有效区分野生与栽培甘草。主成分分析结果与聚类结果相一致。

通过近红外光谱可以获得生物样品中所有有机分子含氢基团和C=O、C=C基团的特征信息，因此土壤、气候、水分等综合因素作用下对野生甘草和栽培甘草的多类成分（如纤维、蛋白、糖类等）产生的影响而形成差异，体现在近红外光谱的差异，从而实现鉴别。已有研究表明，利用红外或近红外光谱可以快速鉴别野生和栽培灯盏花、肉苁蓉、丹参、天麻、栽培和半野生黄芪^[15-19]。而甘草酸、甘草苷及总黄酮的含量也受多种因素影响，但特征类型简单，在野生和栽培甘草中的变化是连续的，因此不能对二者进行有效鉴别。

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[责任编辑 丁广治]