尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用*

黄宇峰 雍之瑶 刘晓明 李浩曦 王善金 巴兆玉 沈彬 赵卫东 吴德升

尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用*

黄宇峰 雍之瑶 刘晓明 李浩曦 王善金 巴兆玉 沈彬 赵卫东 吴德升

目的探讨不同浓度及时间的尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用。方法随机选择5例腰椎骨折患者的椎间盘髓核组织进行体外细胞培养，种于12孔板中，按照0、1、33.3、100、200、500ng/mL的尼古丁浓度以及1、2、3、7、10天加入来培养，每组细胞用Trizol法提取总RNA，用荧光定量PCR测定AQP1，AQP3和II型胶原（Collagen）以及蛋白多糖（Aggrecan）的mRNA表达。用SPSS19.0进行统计分析。结果随着尼古丁浓度升高及培养时间的延长，髓核细胞形态变化明显，贴壁能力减弱，胞质减少，胞核萎缩，空泡形成，凋亡增加。且细胞AQP1及AQP3的mRNA水平随着尼古丁浓度及时间的增加而降低，II型胶原及蛋白聚糖mRNA水平也降低，细胞发生退变。结论尼古丁会降低人椎间盘髓核细胞AQP1和AQP3的表达，进而降低髓核细胞II型胶原和蛋白聚糖的表达，促进椎间盘退变，且作用时间越长，浓度越高，细胞退变越严重。

尼古丁；椎间盘；髓核细胞；退变；水通道蛋白

吸烟是众多慢性疾病的危险因素，且有报道中国吸烟人群在逐年增加[1]。而腰痛是临床上最常见的症状之一，且有研究报道40%患者腰痛由腰椎间盘退变引起[2,3]。在以往的临床研究中，笔者发现吸烟加剧腰椎间盘退变，且吸烟会加重患者腰痛程度[4]。但吸烟如何引起腰椎间盘退变，目前尚未明确，本研究旨在探讨尼古丁是否会影响人椎间盘髓核细胞AQP的表达，进而导致退变。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取5例因腰椎骨折至我院行手术治疗患者的椎间盘组织。5例患均为非吸烟患者，年龄为22～34岁，平均27.3岁，其中男性3例，女性2例。手术节段为L4/5者2例，L5/ S1者3例。所有患者均取得知情同意，且通过上海市东方医院伦理委员会审查。

1.2 髓核细胞培养

1.2.1 原代细胞培养

在无菌超净工作台上仔细分离髓核组织。D-Hanks液冲洗3次至髓核组织中的血污全部洗净，用眼科剪把髓核剪成1mm3大小，置入离心管。37℃以0.25%的胰蛋白酶消化20分钟，每5分钟摇动1次。800rpm低速离心5分钟，吸除上清液。37℃下以0.2%的胶原酶静置消化4小时，至组织块逐渐消失。消化物用筛网过滤。过滤后的液体以800rpm低速离心5分钟，弃去上清液；用HAMF-12培养液冲洗，800rpm低速离心5分钟，重复3次。用计数板进行细胞计数后接种于25cm2的培养瓶中，加入5mL含青霉素100U/ mL、链霉素100U/mL和10%胎牛血清的HAMF-12细胞培养液。37℃、5%的CO2培养箱中培养。每周换液2次，倒置显微镜下观察、拍照。

1.2.2 传代细胞培养

26～28天髓核细胞达到80%融合时进行传代。1瓶细胞传6瓶细胞，编号为0～5。其中0号做空白对照组，根据以往研究报道，常年吸烟者血中尼古丁浓度为4～72ng/mL，平均为33 ng/mL[5]。且尼古丁极易溶于乙醇，难溶于水，但其盐类却易溶于水，故本试验采用尼古丁硫酸盐。因此，1～5号分别使用1、33.3、100、200、500ng/mL浓度尼古丁进行培养。各孔间其余培养条件相同，每种浓度分别培养1、2、3、7、10天。

1.3 荧光定量PCR

1.3.1 总RNA提取

吸净培养板中的培养液，每孔加氯仿/异戊醇（24∶1）0.2mL，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层无色水相转移至另一个1.5mLEP管，加入0.5mL异丙醇，倒转几次，使之充分混匀，-20℃放置10分钟，沉淀RNA；12000 rpm离心10分钟，弃上清；加入lmL75%的乙醇，室温放置5分钟，7500rpm离心5分钟，弃上清；风干沉淀，重悬RNA加20uL的DEPC处理的水中；取溶解的RNAl uL，用DEPC水稀释至0.25mL，测定RNA浓度：OD260×40×250（uL/mL），如纯度OD260/ OD280=1.8-2.0，则用DEPC水把样本RNA浓度调整为1ug/ uL，此时所得的RNA用于下一步的RT-PCR。

1.3.2 逆转录反应

逆转录试剂盒采购自Promega公司，按下列组成配制反应液：5×RNA PCR Buffer 4uL、Rnase Free dH20 7.5uL、MMLV（逆转录酶）1uL、dNTP 2uL、mRNA提取液2uL、Oligodt1uL、Rnasin0.5uL、MgCL22uL。每管反应体积20uL，按以下条件进行反转录反应：室温放置10分钟，42℃60分钟，95℃10分钟，4℃5分钟。

1.3.3 qPCR反应

qPCR试剂盒采购自Takara公司，各目的基因引物序列按表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照下列组成配制反应液：SYBG10uL、RoxII0.4uL、cDNA template 3uL、F-Primer 0.8uL、R-Primer 0.8uL、Rnase Free dH2O 5uL。按以下条件进行PCR扩增：94℃预变性4分钟，94℃预变性50秒，51～60℃复性45秒，72℃延伸60秒，扩增40个循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。

表1 引物合成序列

1.4 统计方法

所得计数数据采用百分率（%）表示，计量数据采用均值±标准差（±s）表示，组间计量资料采用独立样本检验，组内计量资料采用配对样本检验，使用SPSS19.0软件数据录入和分析，以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核细胞培养结果

椎间盘细胞原代培养时24小时后即可见到细胞贴壁，但数目极少。12天后细胞开始部分融合，细胞内分泌颗粒增多。15天后细胞增殖加快，分泌颗粒明显。25～28天左右达到80%融合。在空白对照组中，显微镜下观察髓核细胞生长良好，可分辨出纤维样细胞，软骨样细胞，多为三角形、多角形或星形，胞体透明，折光性强，轮廓不清（图1A）。在33.3ng/mL尼古丁作用下，第1天时髓核细胞胞质轻度萎缩，空白小体增多（图1B）；第2天时胞质进一步萎缩，空白小体增多明显（图1C）；第3天时细胞形态显著改变，细胞内空泡形成，凋亡增加（图1D）；第7天时较第3天凋亡增多，细胞贴壁能力减弱（图1E）；第10天时细胞萎缩，凋亡明显（图1F）。（图1彩图见插页）

图1 A空白对照组在传代培养7天时髓核细胞形态；B-F33.3ng/mL尼古丁培养髓核细胞传代培养1、2、3、7、10天时形态变化（×500）

2.2 qPCR结果

随着尼古丁浓度的增高及培养时间的延长，髓核细胞AQP1及3的mRNA表达水平逐渐降低，且II型胶原及蛋白聚糖的mRNA水平也逐渐降低（图2-5，彩图见插页）

图2 不同浓度及时间尼古丁作用下髓核细胞AQP1 mRNA表达（n=5）

图3 不同浓度及时间尼古丁作用下髓核细胞AQP3 mRNA表达（n=5）

图4 不同浓度及时间尼古丁作用下髓核细胞collagen II mRNA表达（n=5）

图5 不同浓度及时间尼古丁作用下髓核细胞aggrecanmRNA表达（n=5）

3 讨论

吸烟与多种疾病相关，如心脏疾病、肿瘤性疾病、肺部疾病及骨关节退变性疾病等[6,7]。也有研究报道吸烟与慢性腰痛相关[8,9]。而腰椎间盘退变是慢性腰痛主要原因[10]。因此，吸烟可能会导致腰椎间盘退变，进而导致腰痛。在以往研究中，Elmasry等[11]发现吸烟会使椎间盘营养血管收缩变性，椎间盘营养供应减少，进而粘多糖等成分合成减少，椎间盘发生退变，进而导致腰痛；且在戒烟后，患者腰痛随可缓解，但椎间盘的病理变化并不能恢复。Nasto等[12]发现大鼠在短期被动吸烟后，其椎间盘蛋白聚糖及II型胶原成分减少，发生退变，且这些改变与吸烟导致大鼠DNA破坏相关。被动吸烟可以诱发大鼠椎间盘退变且随吸烟时间延长退变加重，其可能与上调椎间盘内IL-1和的表达有关[13]。

椎间盘是一个富含水分的器官，其中髓核的含水量在幼年时高达80%以上，老年时则为70%；而退变椎间盘的一个特征性表现即为含水量的下降，在MRI表现为T2加权信号减弱[14,15]。所以水的代谢在维持椎间盘的正常生理功能中具有重要的作用。而水通道蛋白（aquaporin）是细胞中特异的转运水分子的通道，每个水通道每秒钟可通过109个水分子[16]。Johnson等[17]发现在退变的人髓核细胞中，AQP1和AQP5的表达降低。有研究表明在大鼠椎间盘细胞中只表达AQP1和AQP3，其余几种水通道蛋白不表达[18]。还有学者在人的髓核组织中检测到AQP1和AQP3[19]。但吸烟是否会导致椎间盘髓核细胞水通道蛋白的表达降低，进而导致椎间盘退变，尚未可知。

在本研究中，加入不同浓度尼古丁后，髓核细胞发生退变，且随着时间延长，退变越严重，髓核细胞胞质萎缩，空白小体增多，凋亡明显。并且髓核细胞表达AQP1和AQP3也随着尼古丁浓度的增加及时间的延长而减少，II型胶原及蛋白聚糖的表达也减少，髓核细胞发生退变。因此，尼古丁能够降低人椎间盘髓核细胞AQP1和AQP3的表达，导致退变，且这一过程具有浓度及时间依耐性。这为吸烟导致椎间盘退变提供了基础研究理论依据。

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The effect of nicotine on human nucleus pulposus cells

Huang Yufeng,Yong Zhiyao,Liu Xiaoming,et al.Department of Spine Surgery,Shanghai East Hospital,Shanghai, 200120,China

Objective To evaluate the effect of nicotine on the degeneration of human nucleus pulposus cells.Methods 5 patients undergoing lumbar discectomy surgeries in our department were randomly included.The nucleus pulposus tissues were cultured in well plate and the concentrations of nicotine were 0,1,33.3,100,200,500ng/mL.After 1, 2,3,7,10 days,RNA of cells were extracted using Trizol.The mRNA expression of AQP1,AQP3,collagen II and Aggrecan were valued by rtPCR.Data analysis was done by SPSS19.0.Results With an increase in nicotine concentrationandculturetime,themorphology ofnucleus pulposus changedsignificantly,weakeningoftheadherent ability, showing decrease of cytoplasm,atrophy of cell nucleus and increase of apotosis.The mRNA expression of AQP 1 and AQP3 also decreased and so did collagen II and aggrecan.Conclusion Nicotine can decrease the mRNA expression of AQP 1and AQP3 of nucleus pulposus,thus,causing a decrease in the expression of type II collagen and aggrecanto accelerate disc degeneration.This effect seems to be time and dose dependent.

Nicotine;Intervertebral disc;Nucleus pulposus cell;Degeneration;Aquaporins

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2017.01.004

swgk2016-03-00055

黄宇峰（1979-）男，博士在读。研究方向：脊柱外科。

2016-03-23)

国家自然科学基金面上项目（81672199）；上海市教委产学研项目课题（15cxy50）；2013年上海市东方医院朝阳人才计划（DFZY-8）；浦东新区卫生系统重点学科建设资助（PWzx2014-02）

同济大学附属东方医院脊柱外科，上海200120