绿茶水粗提物抗中波紫外线致人表皮细胞衰老作用

王 振 刘仲华,2,3 -，2，3 蔡淑贤 ,2,3 -，2，3 刘 安 文 祎

(1. 湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心， 湖南 长沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128)

茶是最普及的一种天然饮料，中国已有长达4 700年的饮茶史[1]。绿茶(Green Tea)是中国主要的未发酵茶类之一，茶鲜叶经杀青、揉捻、干燥等工艺加工而成。近年来消费者越来越能接受喝茶预防衰老的观点。绿茶中含有22%～30%多酚类物质和其它活性成分[2]，大量研究结果证明绿茶能够保护机体氧化还原体系[3-4]，保护线粒体的功能与结构，避免线粒体及细胞功能的衰退，对抗衰老有一定作用[5-6]。

紫外线照射引起人表皮细胞衰老，其表现包括造成机体免疫力减弱，组织及器官功能减退，创伤后修复变慢等[7][8]36-37。目前茶提取物在抗氧化活性[9]、抗辐射[10]、抗衰老[11]、抗肿瘤[12]、降脂减肥[13]等功效方面已有大量研究报道。在研究绿茶抗衰老效果模型方面，主要以小鼠模型[14-15]、大鼠模型[16]为主，在衰老诱导方式上主要采用自然诱导[17]、D-半乳糖诱导[18]和热应激诱导[19]，而线虫模型[20]、人皮肤组织模型[21]，紫外线诱导人表皮细胞衰老模型[22]的相关研究报导较少。诸芳等[16]研究表明，绿茶能提高自然衰老下SD大鼠红细胞中SOD活力，减少血清中MDA含量。李琼等[17]的研究表明绿茶多酚能够提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活性，增加海马脑区突触后致密物-95(PSD95)和钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的蛋白表达。但是现阶段对于绿茶抗衰老作用的研究往往仅使用抗氧化指标或补充部分蛋白指标来衡量衰老程度，不够系统。

本研究拟建立UVB致HaCaT细胞衰老模型，并以绿茶水提物对细胞进行预处理，检测不同组细胞相关指标的变化，根据不同组间差距比较，对绿茶水提物抗衰老作用进行评价。为绿茶抗衰老保健品的开发提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

古丈毛尖绿茶：湖南古楼雪峰云雾茶有限公司；

人正常皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT)：中国典型培养物保藏中心(细胞库)；

胎牛血清、高糖DMEM培养基：以色列Biological Industries公司；

磷酸缓冲盐溶液、二甲基亚砜、噻唑蓝(MTT)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

RIPA细胞裂解液：江苏凯基生物技术股份有限公司；

线粒体膜电位检测试剂盒、ATP酶试剂盒：南京建成生物工程研究所；

Annexin V-FITC试剂盒及DCFH-DA试剂盒：碧云天生物技术研究所；

BCA蛋白浓度试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

超净工作台：SW-CJ-1D型，苏州净化设备有限公司；

紫外交联仪：CL-1000型，美国UVP公司；

多功能酶标仪：Varioskan LUX型，美国Thermo公司；

离心机：EBA 270型，德国Rotina公司；

CO2细胞培养箱：NU-4750E型，美国Nuaire公司；

荧光显微镜：IX71型，日本Olympus公司；

旋转蒸发仪：R-210型，瑞士Buchi公司；

冷冻干燥机：Alpha 1-4型，德国Christ公司；

微孔板恒温振荡器：ST60-4型，杭州米欧仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 绿茶水粗提物制备 称取50 g茶叶，加入500 mL沸水，100 ℃水浴提取30 min，每隔10 min搅拌一次，纱布粗过滤，滤液至回收瓶。过滤后的茶渣重复提取一次，纱布粗过滤后合并滤液，然后进行抽滤，滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1/10，冷冻干燥得到绿茶水粗提物冻干粉，密封包装，-20 ℃保存。

1.2.2 细胞培养 将HaCaT细胞接种于10 cm细胞培养皿中，加入含有10%胎牛血清及1%双抗(青霉素-链霉素混合液)的高糖DMEM培养基中。将细胞皿置于CO2培养箱中，培养条件为温度37 ℃、5% CO2浓度。当细胞生长至90%融合时传代，使用含有0.25% EDTA的胰酶消化，消化完成后立即使用培养基终止消化，吹打重悬后移至10 mL离心管中离心。弃上清液，使用高糖DMEM培养基调整细胞密度后接种至所需细胞培养皿中。

1.2.3 细胞分组及处理 待细胞生长融合至70%后，消化细胞，使用高糖DMEM培养基调整细胞密度(96孔、24孔细胞培养板为5×104mL-1，6孔细胞培养板为2.5×106mL-1)后将细胞分为空白组、UVB模型组、绿茶水粗提物实验组(GT-1组、GT-5组、GT-10组、GT-20组)接种至所需培养板(皿)中，吸出培养基，再添加不同绿茶水粗提物浓度的DMEM培养基，各组采用细胞培养板(皿)培养6 h后，吸出培养基，加入少量磷酸缓冲盐溶液(PBS)覆盖细胞，用紫外交联仪对细胞进行紫外线处理，辐照剂量为60 mJ/cm2，空白组使用铝箔覆盖。各组处理后立即吸出PBS溶液，向培养板(皿)中加入不含绿茶水粗提物的DMEM培养基，在培养温度37 ℃、CO2浓度5%条件下培养24 h后，对各指标进行监测分析。细胞分组及处理情况对照见表1。

表1 细胞分组及样品处理对照表

1.2.4 细胞形态观察 使用荧光显微镜进行观察，仪器进行自动白平衡后收集图像。

1.2.5 细胞存活率检测 吸出培养基，向每孔中重新加入100 μL含有0.5 mg/mL噻唑蓝(MTT)的DMEM培养基，在培养温度37 ℃、5% CO2浓度条件下培养4 h，吸出培养基，向每孔中加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，恒温振荡器振荡10 min(温度25 ℃，振荡速度100 r/min)，用多功能酶标仪测定各孔吸光值，检测波长为570 nm。根据吸光值计算不同组细胞存活率，计算公式为：

(1)

式中：

V——细胞存活率，%；

OD1——各孔在570 nm处吸光度；

OD0——空白组各孔在570 nm处平均吸光度。

1.2.6 细胞线粒体膜电位检测 使用JC-1试剂对细胞进行染色。使用荧光显微镜观察染色结果并收集图像，计算不同组红绿荧光平均光密度比(AOD红∶绿)，计算公式为：

(2)

式中：

AOD红∶绿——各组红绿荧光平均光密度比；

IOD红——各组红色荧光光密度；

IOD绿——各组绿色荧光光密度；

S红——各组红色荧光发光面积，Px；

S绿——各组绿色荧光发光面积，Px。

1.2.7 细胞内抗氧化酶、Na+,K+-ATP酶活力及MDA含量检测 吸出培养基，使用PBS溶液清洗残留的培养基，每孔中加入1 mL RIPA细胞裂解液收集细胞。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按照试剂盒说明书要求及步骤测定Na+,K+-ATP酶活力、GSH-Px、SOD、CAT、LDH活性及MDA含量。

1.2.8 细胞内ROS测定 吸出培养基，每孔加入200 μL含有10 μmol/mL二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)的无血清DMEM培养基，置于CO2培养箱中继续培养20 min后，使用无血清的DMEM培养基清洗3次，彻底去除残留的DCFH-DA。在荧光显微镜下使用白光及绿光进行观察，白光进行白平衡后收集图像，通过不同组平均光密度差异，计算ROS含量，计算公式为：

(3)

式中：

A——ROS含量，%；

AOD1——各组荧光光密度；

IOD0——空白组荧光光密度；

S1——各组荧光发光面积，PPI；

S0——空白组荧光发光面积，PPI。

1.2.9 细胞凋亡情况测定 吸出培养基，使用PBS溶液洗涤后依次加入195 μL Annexin V-FITC结合液，5 μL Annexin V-FITC工作液，10 μL碘化丙啶染色液(PI)，置于室温(20～25 ℃)下避光孵育20 min。孵育结束后立即在荧光显微镜下使用白光、绿光及红光进行观察，白光进行白平衡后收集图像，分析不同组荧光染色情况。

1.3 数据分析

以GraphPad Prism 6.02软件对试验数据进行统计分析，采用ANOVA进行单因素方差分析；以Image pro plus 6软件进行光度分析。

2 结果与分析

2.1 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞形态的影响

细胞形态变化是细胞衰老过程中各结构退行性变化的直观体现，主要包括细胞体积及细胞核体积变大，核膜内折，染色质固缩，细胞颜色加深等。由图1可见：空白组细胞生长紧密，细胞呈现梭形。模型组细胞数量明显减少，细胞生长松散，细胞体积变小，细胞核体积变大，细胞变圆。各试验组(GT-1、GT-5、GT-10)细胞减少、细胞变圆、细胞核变大情况较模型组有明显改善。模型组细胞符合衰老细胞特征，而GT-1、GT-5、GT-10试验组细胞衰老特征不明显，说明绿茶水粗提物能保护紫外线诱导后的细胞形态，降低中波紫外线照射后细胞的衰老水平。

图1 不同处理组显微镜下的细胞形态图Figure 1 Cell morphologic map of different treatment groups under microscope

2.2 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞存活率的影响

细胞衰老往往伴随着细胞凋亡水平上升，从而导致细胞存活率下降。由表2可见，与空白组相比，模型组细胞存活率下降至(71.59±2.91)%，两者在P<0.01水平差异显著；随着培养基中绿茶水粗提物浓度的提高，GT-1、GT-5、GT-10、GT-20组的细胞存活率均有明显提高，其中GT-10组提高到(93.44±6.22)%。GT-5组、GT-10组、GT-20组与模型组相比在P<0.01水平差异显著，GT-1组与模型组相比在P<0.05水平差异显著。说明绿茶水粗提物能提高紫外线诱导后的细胞存活率。

2.3 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞膜电位的影响

细胞衰老过程中，细胞呼吸功能减退，线粒体活动减弱，线粒体膜两侧电位降低，表现出线粒体膜去极化的趋势。线粒体膜电位较高使JC-1能聚集在线粒体基质中形成能产生红色荧光的聚合物；线粒体膜电位下降时，JC-1不会大量在线粒体基质中聚集，而是多以单体形式存在，产生绿色荧光。因此，衰老细胞在经过JC-1染色后，红绿荧光平均光密度比会明显下降。由图2可见，图片叠加后空白组图片色调偏向橙黄色，而模型组整体偏绿。使用软件统计空白组、模型组、GT-10组红绿荧平均光密度，计算得到空白组、模型组、GT-10组红绿荧光平均光密度比(AOD红：绿)分别为2.742，2.203，2.506，GT-10组AOD红：绿相对模型组提高了13.75%。结果表明，绿茶水粗提物能降低紫外线诱导后的细胞线粒体膜的去极化趋势。与空白组相比，模型组绿色荧光较强、红色荧光较弱。在染色过程中，模型组JC-1单体比例较高，即模型组细胞线粒体膜电位较低，表现出较强的线粒体膜去极化的趋势，而GT-10组去极化趋势比模型组要小，说明细胞衰老较轻。

表2 不同浓度绿茶水粗提物紫外线诱导处理的细胞存活率†

† *表示试验组与模型组在P<0.05水平差异显著，**表示试验组与模型组在P<0.01水平差异显著； ##表示模型组与空白组比较在P<0.01水平差异显著；※各孔差异为(试验组每个孔存活率/模型组平均存活率)-1，并对结果进行统计学分析得到各组存活率差异。

图2 不同处理组荧光显微镜下细胞JC-1染色图Figure 2 JC-1 staining of cells in different treatment groups under fluorescence microscope

2.4 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞Na+，K+-ATP酶活力的影响

Na+，K+-ATP酶在维持细胞膜通透性和细胞正常跨膜运输中具有重要作用。随着细胞衰老，细胞内Na+，K+-ATP酶活力随之降低，从而影响到细胞膜正常的生理功能。同时Na+，K+-ATP酶还与细胞膜电位差的形成即细胞兴奋相关，细胞兴奋状态下新陈代谢得以加强，有助于抵抗衰老。由表3可见，绿茶水粗提物能提高紫外线诱导后的细胞Na+，K+-ATP酶活力。UVB处理后，模型组Na+，K+-ATP

酶活力[(14.25±0.3) U/mg·Prot]明显低于空白组[(29.86±0.93) U/mg·Prot]，而GT-10组经过绿茶水粗提物预处理后Na+，K+-ATP酶活力能保持在(29.06±0.52) U/mg·Prot，表明绿茶水粗提物能预防中波紫外线照射引起的细胞衰老。

2.5 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞内抗氧化酶活力及氧化产物的影响

氧化还原失衡是机体衰老的重要诱因之一[23]，经典的小鼠衰老模型是用D-半乳糖诱导小鼠衰老，以GSH-Px、SOD活力及MDA含量作为衰老指标。而CAT作为SOD的下游，能将SOD反应产物过氧化氢进一步分解，补充SOD在抗氧化方面的作用。

由表4可见，模型组与空白组相比，细胞内GSH-Px、CAT、SOD活力分别下降(77.52±6.33)%，(54.51±4.17)%，(44.46±3.79)%，MDA含量提高(136.64±12.78)%，细胞内抗氧化酶活力明显降低，氧化产物堆积。而GT-1、GT-5、GT-10、GT-20组抗氧化酶活力及MDA含量均有改善，其中GT-10组GSH-Px、CAT、SOD活力分别提高(257.74±110.26)%，(82.52±5.60)%，(72.22±5.79)%、MDA含量下降(50.69±6.81)%，氧化酶活力明显提高，氧化产物减少。说明绿茶水粗提物能提高紫外线诱导后细胞中GSH-Px、SOD、CAT活力，降低MDA含量，维持细胞内氧化还原平衡，预防中波紫外线照射引起的细胞衰老。

表3 不同浓度绿茶水粗提物紫外线诱导处理的细胞ATP酶活力†

† *表示试验组与模型组在P<0.05水平差异显著，**表示试验组与模型组在P<0.01水平差异显著；##表示模型组与空白组比较在P<0.01水平差异显著；※各孔差异为(试验组每个孔酶活力/模型组平均酶活力)-1，并对结果进行统计学分析得到各组酶活力差异。

表4 不同浓度绿茶水粗提物紫外线诱导处理的细胞抗氧化酶活力及MDA含量†

† *表示试验组与模型组在P<0.05水平差异显著，**表示试验组与模型组在P<0.01水平差异显著；##表示模型组与空白组比较在P<0.01水平差异显著。

2.6 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞内ROS含量的影响

生物体衰老是过量自由基积累引起的，ROS在体内大量产生，超过机体自身对ROS的清除能力时，ROS会在体内大量积累，ROS能与蛋白质等大分子交联，影响其正常生理功能；同时ROS还会造成mtDNA的损伤，加速细胞衰老[24]。由图3可见，与空白组细胞相比，模型组绿色荧光较强，细胞内ROS含量较高；而GT-10组荧光值较模型组要弱，说明其ROS含量较少。使用软件对图片进行分析后发现，空白组、模型组、GT-10组相对平均光密度分别为49.598，76.222，65.054，以空白组ROS含量为100%，模型组相较空白组ROS含量增加53.67%，GT-10组相较模型组减少17.16%。说明绿茶水粗提物能通过抑制ROS的积累，预防中波紫外线照射引起的细胞衰老。

图3 不同处理组荧光显微镜下细胞DCFH-DA染色图

Figure 3 DCFH-DA staining of cells in different treatment groups under fluorescence microscope

2.7 绿茶水粗提物对紫外诱导衰老细胞凋亡水平的影响

细胞衰老过程往往伴随着细胞凋亡，细胞衰老时ROS积累，氧化水平上升引起线粒体膜通透性改变，线粒体释放细胞色素C(Cyt-C)，激活Caspase-9进入激活Caspase-3，形成凋亡小体引起细胞凋亡。因此细胞凋亡水平能在一定程度上表现细胞衰老水平。在细胞凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻，Annexin-FITC与之结合产生绿色荧光；凋亡晚期细胞膜通透性改变，碘化丙啶(PI)能进入细胞与细胞核结合，产生红色荧光，根据两种荧光能够判断细胞的凋亡水平。由图4可见，模型组Annexin-FITC染色与PI染色荧光均显著高于空白组，而GT-10组荧光与模型组相比较低，说明UVB处理后细胞凋亡水平明显升高，而绿茶水粗提物对此有抑制作用。说明绿茶水粗提物能预防中波紫外线照射引起的细胞衰老。

图4 不同处理组荧光显微镜下细胞Annexin-FITC染色图

Figure 4 Annexin-TITCstaining of cells in different treat-ment groups under fluorescence microscope

3 结论

通过对中波紫外线诱导人表皮角质形成细胞衰老特征变化的比较分析，发现绿茶水粗提物能预防UVB诱导后模型细胞表现出的衰老特征，有效改善细胞体积、形状、核体积等细胞形态，抑制细胞凋亡趋势；提高细胞存活率和细胞内抗氧化酶活力，降低细胞内氧化产物(MDA)含量，抑制细胞内ROS的积累，抑制细胞线粒体膜电位去极化的趋势，提高细胞内Na+，K+-ATP酶活力。表明绿茶水粗提物抗中波紫外线诱导人表皮角质形成细胞衰老具有较好的效果，为绿茶抗衰老产品研发提供科学依据。

现阶段的研究中对于衰老机理的学说主要有自由基氧化应激学说、细胞凋亡学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说、TOR分子理论5种[25]，中波紫外线可能通过增加细胞内ROS含量与凋亡水平的方式诱导细胞衰老，而绿茶水粗提物能够显著抑制中波紫外线引起细胞内ROS含量增加与凋亡水平上升，因此可能通过这些途径抑制中波紫外线诱导人表皮角质形成细胞衰老。本研究结果符合自由基氧化应激学说与细胞凋亡学说的观点，与韩小苗[26]、马蕊[8]35、赵海梅[27]等使用D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型、UVB诱导表皮细胞模型和人内皮细胞自然衰老模型得到的变化趋势一致。绿茶水粗提物各成分组成、含量、抗衰老功能作用与机制还有待进一步研究。

[1] 良石, 杨焕瑞. 中医话茶疗[M]. 哈尔滨: 黑龙江科技出版社, 2008: 扉页.

[2] 连艳玲, 何东仪. 表没食子儿茶素没食子酸酯的免疫调节机制研究进展[J]. 上海预防医学, 2010, 22(10): 538-541.

[3] 林勇, 刘仲华, 马蕊. 茶叶中表没食子儿茶素没食子酸酯抑制中波紫外线诱导HaCaT细胞氧化损伤研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2015(4): 1 224-1 228.

[4] 林向飞. 不同剂型的光保护药物对UVB光损伤的干预作用及其对相关调控分子影响的实验研究[D]. 南京: 南京医科大学, 2005: 89-100.

[5] 贺音. EGCG缓解丙烯酰胺诱导的大鼠肝脏及神经损伤机理研究[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2017: 65-55.

[6] 尹述婷. EGCG对铅致大鼠海马神经元突触可塑性和氧化损伤的修复作用及机制[D]. 合肥: 中国科学技术大学, 2009: 64-65.

[7] 梁治学, 胡燕, 李其忠, 等. “衰老”词源学探析[J]. 中国老年学杂志, 2015, 35(22): 6 619-6 620.

[8] 马蕊. 茶叶水提物抗皮肤光老化的作用及机理研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2013.

[9] 潘顺顺, 赖幸菲, 孙伶俐, 等. 不同季节翠玉品种3大茶类生化成分及抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发, 2017, 38(9): 22-27.

[10] 王舟, 曾令福, 肖元梅, 等. 绿茶抗辐射损伤作用研究[J]. 四川大学学报: 医学版, 2003, 34(2): 303-305.

[11] 李军. 绿茶多酚抗衰老作用的实验研究[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2013: 40-14.

[12] 冯强, 李毅, 王文洋, 等. 绿茶提取物对乳腺癌细胞株MCF-7的作用机制探讨[J]. 中国实验诊断学, 2016, 20(12): 1 999-2 002.

[13] 刘安军, 郭丹霄, 刘慧慧, 等. 绿茶提取物的降血脂及减肥作用研究[J]. 现代食品科技, 2012, 28(6): 601-605.

[14] LI Jun, LIN Li-wen, XIN Qin, et al. Anti-aging effect of green tea polyphenols on D-galactose-induced subacute aging in mice[J]. Food & Drug, 2013, 15(2): 106-109.

[15] LIU Hua, SHEN Xue-hui-zi, NIE Lan, et al. Study on Influence of se-enriched and zinc-enriched green tea on anti-oxidation and anti-aging of mice in guizhou[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2014, 42(28): 9 657-9 660.

[16] 褚芳, 万筱荣, 周银平, 等. 两种茶叶对SD大鼠营养保健功能与抗衰老作用的研究[J]. 中国比较医学杂志, 2000, 10(2): 94-97.

[17] 李琼, 李勇. 绿茶多酚预防老龄C57BL/6J小鼠学习记忆功能衰退实验研究[J]. 科技导报, 2009, 27(22): 26-31.

[18] 初晓, 姚如泳, 韩志武. 茶多酚对D-半乳糖致衰老小鼠免疫功能的调节作用[J]. 中国医院药学杂志, 2006, 26(5): 637-638.

[19] 张健炜. 红茶提取物抗衰老效应研究[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2013: 17-19.

[20] XIONG Li-gui, CHEN Yi-jun, TONG Jie-wen, et al. Epigallocatechin-3-gallate promotes healthy lifespan through mitohormesis during early-to-mid adulthood in Caenorhabditis elegans[J]. Redox Biol, 2017, 14: 305.

[21] 高雅倩, 王曦, 金银珠, 等. 含灰树花子实体及绿茶提取物眼霜的抗衰老功效研究[J]. 中国美容医学杂志, 2014, 23(17): 1 404-1 407.

[22] 陈文琦, 许惠娟, 毕志刚. UVB照射诱导皮肤成纤维细胞早期衰老的研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2010, 43(2): 98-100.

[23] 胡明曦, 张栩, 陈畅. 细胞氧化还原调控与衰老[J]. 生物化学与生物物理进展, 2014, 41(3): 288-294.

[24] 张军, 张敬, 石红军, 等. 茶多酚对紫外线引起的DNA损伤的保护作用[J]. 同济大学学报: 医学版, 2004(2): 91-92, 97.

[25] 游庭活, 温露, 刘凡. 衰老机制及延缓衰老活性物质研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2015, 27(11): 1 985-1 990.

[26] 韩小苗, 吴苏喜, 吴美芳, 等. 红花籽油对D-半乳糖致衰老小鼠模型的抗衰老作用[J]. 食品与机械, 2016, 32(10): 127-131.

[27] 赵海梅, 杨斌, 成蓓. 衰老血管内皮细胞线粒体膜电位与活性氧的变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(15): 2 729-2 734.