齐口裂腹鱼骨胶原蛋白超声波辅助提取工艺及其特性研究

严秋萍 - 邬应龙 - 李月娥 - 蒋 艳 郭玉春 - 秦 涛

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

胶原蛋白是动物的主要结构蛋白，具有支撑器官、保护机体的作用[1]。胶原蛋白右旋三股超螺旋结构使其具有较强的拉伸强度[2]，其功能具有多样性和复杂性[3]。胶原蛋白主要分布在动物的骨、软骨和皮肤等组织中[4]，从水产动物中提取的胶原蛋白比陆生动物性胶原蛋白更安全，具有广阔的开发前景[5]，可广泛应用于食品、化妆品及生物制品的生产中[6-8]。齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)属鲤形目，鲤科，裂腹鱼亚科，裂腹鱼属，裂腹鱼亚属，主要分布于长江上游、大渡河、青衣江和汉江的上游，是产区名贵的经济鱼类[9]。齐口裂腹鱼肉质细嫩，肉色雪白，味道鲜美，颇受大众消费者的喜爱[10]。但目前对其鱼骨的应用还鲜有报道，如不加以有效的利用将会造成资源的浪费和环境的污染。

研究[11]发现，一定浓度的酸液可破坏蛋白质分子之间的氢键，引起胶原纤维膨胀、溶解，使胶原蛋白从原料中释放出来，常用来提取胶原蛋白的酸有柠檬酸、盐酸、乙酸、乳酸等。刘娟等[12]研究发现以浓度为0.54 mol/L的乙酸为提取剂，在温度36.4 ℃，液料比51∶1 (mL/g)条件下提取齐口裂腹鱼皮中的胶原蛋白36 h，提取率可达67.26%。吴缇等[13]分别用柠檬酸与乙酸作为提取剂提取斑点叉尾鮰鱼骨胶原蛋白，结果显示2种方法提取的胶原蛋白提取率无显著差异，但乙酸提取的胶原蛋白具有刺鼻的酸味。王林等[14]采用超声波辅助提取深海红鱼胶原蛋白，结果表明胶原蛋白的提取时间缩短了30 h。

目前，中国对冷水鱼胶原蛋白提取方法的研究较少，主要是借鉴陆生动物胶原蛋白的提取方法[15]，如酸法提取和酶法提取，提取效率低且受环境因素影响较大。超声提取技术是通过机械破碎和空化作用促进浸提物向提取剂中扩散，具有能耗低、提取率高等优点[16]。本试验拟采用超声波辅助的方法以柠檬酸作为提取剂，探讨齐口裂腹鱼骨胶原蛋白的提取方法，并对纯化的鱼骨胶原蛋白特性进行分析，为鱼骨胶原蛋白的提取和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

齐口裂腹鱼：购买于雅安市天全县齐口裂腹鱼养殖场，体重为(80.58±3.06) g，取其脊椎骨作为试验材料，放入保鲜袋，-20 ℃冻藏贮存，备用。

1.2 试剂及仪器

L-羟脯氨酸标准品：含量≥99%，美国Sigma公司；

浓盐酸、柠檬酸、柠檬酸钠、高氯酸、对二氨基苯甲醛、氯胺T、氢氧化钠、尿素、硫脲、EDTA(乙二胺四乙酸)、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris碱、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等：分析纯；

pH计：PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；

摇床：TS-2000A型，海门市麒麟医用仪器厂；

紫外-可见分光光度计：UV-2102PCS型，上海尤尼柯仪器有限公司；

垂直电泳仪：Mini-PROTEAN Tetra System型，美国Bio-Rad公司；

凝胶成像仪：GelDoc2000型，美国Bio-Rad公司；

高速氨基酸分析仪：835-50型，日本日立公司；

乌氏黏度计：227型，内径0.5～0.6 mm，上海申谊玻璃制品有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制 精确称取羟脯氨酸0.1 g，用0.001 mol/L的盐酸溶解，配制成1 g/L羟脯氨酸贮存液，将贮存液稀释成不同浓度的羟脯氨酸标准液；取1 mL标准溶液于试管中，以0.001 mol/L的盐酸作空白液，向标准液和空白液中加2 mL氯胺T溶液，室温静置20 min；加入2 mL 高氯酸，混匀后室温静置5 min，再加入2 mL显色液60 ℃水浴15 min；流水冷却后，以空白液调零，560 nm下测定吸光值[17]。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制羟脯氨酸标准曲线，得回归方程为：Y=0.007 5x-0.000 8，相关系数R2=0.999 1。

1.3.2 齐口裂腹鱼鱼骨的预处理 鱼骨充分剁碎后，用其质量10倍的0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h[18]，再用2.5% NaCl浸泡4 h[19]，去除非胶原蛋白成分及防止内源性蛋白酶对胶原蛋白的影响；鱼骨用蒸馏水反复洗涤沥干，用其质量5倍的0.5 mol/L EDTA溶液(pH 7.4)于4 ℃下浸泡5 d，每天更换1次EDTA溶液以脱去钙质；用蒸馏水反复洗涤后沥干[20]，加入其质量20倍的10%异丙醇溶液于4 ℃下浸泡1 d 以去除脂肪；用蒸馏水冲洗鱼骨至中性，沥干，贮存于-20 ℃ 冰箱中备用。

1.3.3 胶原蛋白提取得率的计算 取胶原蛋白提取液1 mL，加入3 mL 6 mol/L的盐酸，105 ℃条件下水解5 h；水解液用超纯水分次转移至50 mL容量瓶定容，取1 mL溶液于试管中，按1.3.1羟脯氨酸标准曲线的绘制方法测定吸光值，按式(1)计算胶原蛋白提取得率[21-22]。

(1)

式中：

c——胶原蛋白提取得率，%；

m1——羟脯氨酸的质量，g；

m2——鱼骨总质量，g。

1.3.4 鱼骨胶原蛋白的提取方法优化

(1) 液料比对胶原蛋白提取得率的影响：选取25∶1，50∶1，75∶1，100∶1，125∶1 (mL/g)的液料比，0.5 mol/L柠檬酸为提取剂，超声波功率300 W，超声波预处理时间20 min，提取温度30 ℃，提取时间48 h，以胶原蛋白提取得率为评价指标确定料液比。

(2) 超声波预处理时间对胶原蛋白提取得率的影响：选取0，10，20，30，40 min的超声波预处理时间，0.5 mol/L柠檬酸为提取剂，超声波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，提取温度30 ℃，提取时间48 h，以胶原蛋白提取得率为评价指标确定超声波预处理时间。

(3) 提取温度对胶原蛋白提取得率的影响：选取20，25，30，35，40 ℃的提取温度，0.5 mol/L柠檬酸为提取剂，超声波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超声波预处理时间20 min，提取时间48 h，以胶原蛋白提取得率为评价指标确定提取温度。

(4) 提取时间对胶原蛋白提取得率的影响：选取24，36，48，60，72 h的提取时间，0.5 mol/L柠檬酸为提取剂，超声波功率300 W，液料比75∶1 (mL/g)，超声波预处理时间20 min，提取温度30 ℃，以胶原蛋白提取得率为评价指标确定提取时间。

(5) 正交试验设计：在单因素试验基础上以液料比、超声波预处理时间、提取温度、提取时间作为影响因素，各取3个水平，采用L9(34)正交试验设计，研究齐口裂腹鱼骨胶原蛋白提取最优条件并对该条件进行验证。

1.3.5 鱼骨胶原蛋白的纯化方法 鱼骨胶原蛋白提取液过滤后向滤液中加入NaCl至最终浓度为0.9 mol/L盐析过夜；于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集沉淀，用10倍体积的0.5 mol/L柠檬酸溶解沉淀，重复盐析和溶解[23]；将鱼骨胶原蛋白溶液转入透析袋于超纯水中透析3 d，每天更换超纯水2～3次；将透析袋中的胶原蛋白溶液真空冷冻干燥后得到鱼骨胶原蛋白成品。

1.3.6 鱼骨胶原蛋白特性分析

(1) 紫外光谱扫描：精确称取骨胶原蛋白成品0.005 g溶于5 mL 0.5 mol/L的柠檬酸中，振荡使其全部溶解，样品经4 ℃离心(10 000 r/min，5 min)后取上清液在波长200～400 nm进行紫外光谱扫描[24]。

(2) SDS-PAGE电泳及纯度测定：聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度4%，上样量10 μL。采用恒压电泳跑胶，样品在浓缩胶时电压保持在80 V，当样品进入分离胶后保持电压120 V，在样品快接近分离胶底部时，终止电泳[25]。电泳结束后将凝胶放入含1 g/L考马斯亮蓝R-250、45%甲醇和10%冰醋酸的染色液中染色2～3 h，用10%甲醇和10%冰醋酸脱色，中途更换脱色液，直至条带清晰。

精确称取0.005 g样品溶于5 mL 6 mol/L盐酸中，在105 ℃条件下水解24 h，在40 ℃条件下旋转蒸发去除盐酸，用超纯水定容至50 mL。吸取1 mL样液，按标准曲线的绘制方法测定吸光值，根据待测样品羟脯氨酸浓度按式(2)计算胶原蛋白纯度。

(2)

式中：

w——胶原蛋白纯度，%；

C——羟脯氨酸质量浓度，μg/mL；

m——样品质量，mg；

V——样品总体积，mL；

F——换算系数11.1。

(3) 氨基酸组成测定：根据Li等[26]的测定方法修改如下：取齐口裂腹鱼骨胶原蛋白样品0.005 g在110 ℃条件下经5 mL 6 mol/L盐酸水解24 h后，用氨基酸分析仪进行氨基酸组成的分析。

(4) 热变性温度测定：根据刘庆慧等[27]和钟朝辉等[28]的测定方法修改如下：取适量齐口裂腹鱼骨胶原蛋白溶于10 mL 0.5 mol/L柠檬酸，采用乌氏黏度仪测定样品在毛细管中的流出时间t，每个温度重复测定3次，以0.5 mol/L柠檬酸作为空白液，测定值为t0(控制t/t0在1.2～2.0为宜)。在15～40 ℃内测定胶原蛋白溶液的分数黏度，每个温度水平恒温30 min后测定。根据样品的流出时间及空白液流出时间计算样品的分数黏度，并以温度为横坐标、分数黏度为纵坐标制图，以分数黏度变化一半时所对应的温度为胶原蛋白热变性温度。计算公式：

ηr=t/t0，

(3)

ηsp=ηr-1，

(4)

(5)

式中：

ηr——相对黏度；

ηsp——增比黏度；

η0——分数黏度；

t——样品流出时间，s；

t0——柠檬酸流出时间，s；

T——测定温度，℃。

2 结果与分析

2.1 胶原蛋白提取条件的选择

2.1.1 液料比对胶原蛋白提取得率的影响 由图1可知，液料比在较低范围内，鱼骨不能充分浸泡使得提取效果较差，随着液料比的提高鱼骨与提取剂充分接触，柠檬酸通过破坏蛋白质分子之间的氢键，胶原蛋白从原料鱼骨中释放使得提取得率显著升高(P<0.05)，液料比为75∶1 (mL/g)时胶原蛋白提取得率最高。随着液料比的继续增加，鱼骨中胶原蛋白基本释放完全，提取得率趋于平稳(P>0.05)。液料比的继续增加会降低胶原蛋白在提取液中的浓度，增大胶原蛋白分离纯化的难度，遵循经济方便的原则确定最佳液料比为75∶1 (mL/g)。

图1 液料比对胶原蛋白提取得率的影响Figure 1 Effect of liquid-solid ratio on collagen extraction yield

2.1.2 超声波预处理时间对胶原蛋白提取得率的影响 由图2可知，随超声波预处理时间的延长，齐口裂腹鱼胶原蛋白提取得率不断增大，经超声波预处理的鱼骨胶原蛋白提取得率显著高于未处理组(P<0.05)，说明超声波辅助可提高鱼骨胶原蛋白提取得率。当超声波预处理时间超过20 min后，胶原蛋白提取得率呈下降趋势(P>0.05)，可能是超声波具有的机械剪切作用和空化效应使提取液中胶原蛋白发生部分分解。故确定超声波预处理时间为20 min。

2.1.3 提取温度对胶原蛋白提取得率的影响 由图3可知，提取温度对齐口裂腹鱼胶原蛋白提取得率的影响较大，随着提取温度的上升胶原蛋白提取得率显著升高(P<0.05)，温度为30 ℃时胶原蛋白提取得率最高。当提取温度超过35 ℃ 时，提取得率显著下降(P<0.05)，可能是胶原蛋白稳定性较差，提取温度过高导致胶原蛋白转化为明胶等物质或者是破坏其结构使其分解[29]。故选择30 ℃为最佳提取温度。

图2 超声波预处理时间对胶原蛋白提取得率影响Figure 2 Effect of ultrasonic pretreatment time on collagen extraction yield

图3 提取温度对胶原蛋白提取得率的影响Figure 3 Effect of extraction temperature on collagen extraction yield

2.1.4 提取时间对胶原蛋白提取得率的影响 胶原蛋白从原料骨中释放是一个缓慢的过程，由图4可知，提取时间为24 h鱼骨中胶原蛋白提取得率较低，随着提取时间的延长胶原蛋白提取得率呈上升趋势，提取时间为48 h胶原蛋白提取得率达到最大值。由于胶原蛋白长时间处于酸性环境中会发生部分变性，导致提取液中胶原蛋白含量减少，提取得率呈下降趋势(P>0.05)。为提高提取效率、缩短周期，故确定最佳提取时间为48 h。

图4 提取时间对胶原蛋白提取得率的影响Figure 4 Effect of extraction time on collagen extraction yield

2.1.5 正交试验 在单因素试验结果的基础上，采用L9(34) 正交试验设计确定胶原蛋白的最优提取参数。正交试验因素及水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2可知，根据极差分析各因素对胶原蛋白提取得率的影响次序为：A>C>B>D，最优组合为A2B2C2D3，结合胶原蛋白的提取得率及单因素的结果，考虑实际操作的方便及经济原则[30]，修正齐口裂腹鱼骨胶原蛋白提取方法为A2B2C2D2，即提取温度30 ℃、超声波预处理时间20 min、提取时间48 h、液料比75∶1 (mL/g)，在该条件下进行验证实验，重复3次，结果显示，胶原蛋白的提取得率为6.91%，优于正交试验中最大值，因此，此条件可用于齐口裂腹鱼骨胶原蛋白的提取。

表1 L9(34)正交试验因素水平

表2 正交试验结果

2.2 胶原蛋白特性分析

2.2.1 紫外光谱扫描 胶原蛋白与大多数蛋白质的区别在于几乎不含色氨酸，因此，在280 nm处不会有紫外吸收峰的出现，可作为一种鉴定胶原蛋白纯度的方法。由图5可知，齐口裂腹鱼骨胶原蛋白溶液在紫外光谱220～232 nm范围内有一个较强的吸收峰，在257，275，280 nm处有较弱的吸收峰，表明苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在胶原蛋白一级结构中含量较低，其紫外吸收峰特性与黄石溪[31]酸法提取的草鱼骨胶原蛋白紫外扫描220～230 nm内有一个尖锐的吸收峰的结果相似，说明在该试验条件下提取的鱼骨胶原蛋白纯度较高，且符合I型胶原蛋白的紫外吸收特征。胶原蛋白在紫外光谱200～220 nm范围内有微弱的峰，可能是由于胶原蛋白溶液中柠檬酸的影响。

图5 齐口裂腹鱼骨胶原蛋白的紫外吸收光谱Figure 5 UV absorption spectra of collagen in the Schizothorax prenanti bone

2.2.2 SDS-PAGE电泳 在SDS-PAGE电泳中胶原蛋白的电泳迁移率只取决于相对分子量大小，因此，此方法可用于胶原蛋白样品的分子组成及分子质量分析(结果见图6)。齐口裂腹鱼骨胶原蛋白由两条α链(α1链和α2链)和一条β链组成，β链的分子量约为200 kDa，α1链与α2链分子量在110～130 kDa，而且α1链的条带比α2链的要深，说明α1链在胶原蛋白中的含量高于α2链。同时，图谱上几乎不含其他的杂带，说明提取的齐口裂腹鱼骨胶原蛋白纯度较高，通过测定样品的吸光值按回归方程计算得胶原蛋白纯度为89.74%。

图6 齐口裂腹鱼骨胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Figure 6 SDS-PAGE analysis of collagen in the Schizothorax prenanti bone

SDS-PAGE电泳结果与陈申如等[32]对淡水鱼鱼骨胶原蛋白特性研究中β肽链分子量约为200 kDa，α1肽链分子量约为130 kDa，且α2肽链含量相对较低的结果相似。此外，叶韬等[33]研究发现罗非鱼骨胶原蛋白中α1链的相对分子质量约为120 kDa，α2链的相对分子质量在100～120 kDa，β链的相对分子质量略大于200 kDa，α1链的含量最高，其次是α2链，而β链含量最低。经纯度分析，胶原蛋白样品纯度为89.74%，符合SDS-PAGE电泳中条带单一的结果。

2.2.3 氨基酸组成 由表3可知，齐口裂腹鱼骨胶原蛋白中各种氨基酸含量相对丰富，其中甘氨酸含量最高，占总氨基酸含量的31.21%；亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)含量较多，占总氨基酸含量的20.66%；其次是丙氨酸和谷氨酸，分别占总氨基酸含量的10.18%和7.31%；组氨酸和酪氨酸含量较少，不含色氨酸，只有极少量的半胱氨酸。氨基酸分析结果符合胶原蛋白的氨基酸组成特征，与紫外扫描图谱结果分析一致，说明采用超声波辅助提取可保持胶原蛋白的完整性。

2.2.4 热变性温度 由图7可知，温度为25 ℃时分数黏度值呈下降的趋势，说明胶原蛋白开始发生部分变性，当温度为31.4 ℃时，分数黏度值为最大值的一半，此温度即为齐口裂腹鱼骨胶原蛋白热变性温度，与鲤鱼骨胶原蛋白热变性温度30 ℃接近[34]。同时也说明正交试验中胶原蛋白最佳提取温度确定为30 ℃是合理的。

表3 齐口裂腹鱼骨胶原蛋白氨基酸组成

图7 齐口裂腹鱼骨胶原蛋白热变性温度曲线Figure 7 Temperature curve of thermal denaturation of collagen in the Schizothorax prenanti bone

研究表明，胶原蛋白的热变性温度与亚氨基酸的含量正相关，主要是由于亚氨基酸中的吡咯环与羟脯氨酸的羟基所形成的氢键增强了胶原蛋白结构的稳定性[35]，与上述齐口裂腹鱼骨胶原蛋白氨基酸分析结果一致；相关研究还表明：鱼类胶原蛋白的热变性温度与其生活环境的水温也存在一定的相关性，大致与其最高水温相等[36]，吴青等[37]研究发现齐口裂腹鱼幼鱼在水温30 ℃时已经出现呼吸频率加快，不摄食现象，生存的临界温度上限为33.5 ℃，与齐口裂腹鱼骨胶原蛋白变性温度31.4 ℃接近。

3 结论

本研究结果表明，齐口裂腹鱼骨中的胶原蛋白最优提取条件为：提取温度30 ℃、超声波预处理时间20 min、提取时间48 h、液料比75∶1(mL/g)，胶原蛋白提取得率可达6.91%。齐口裂腹鱼骨胶原蛋白为I型胶原蛋白，采用超声波技术与柠檬酸结合应用于齐口裂腹鱼骨胶原蛋白提取可提高产品得率，保持胶原蛋白的完整性且纯度较高，但提取时间较长。如何将超声波技术与其他提取方法结合最大限度缩短提取时间并提高产品得率和纯度，还有待研究。近年来，水产胶原蛋白的相关研究越来越多，同时水产动物原料的低脂高蛋白的特性非常适用于胶原产品的制备[38]，从宗教信仰，节约资源，保护环境方面考虑，鱼骨胶原蛋白的进一步研究一定具有重要的科学意义和市场价值。

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