三种甘蔗叶片蛋白质分离纯化方法比较及双向电泳体系优化

周桂，邹成林，丘立杭，，刘小霞，毛江江，杨丽涛，李杨瑞，*

（1.广西民族大学海洋与生物技术学院/广西微生物与植物资源利用重点实验室/广西高校化学与生物转化过程重点实验室，南宁530008；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室/广西农业科学院/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/中国农业科学院甘蔗研究中心，南宁530007；3.广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004）

三种甘蔗叶片蛋白质分离纯化方法比较及双向电泳体系优化

周桂1，邹成林2，丘立杭2，3，刘小霞1，毛江江1，杨丽涛3，李杨瑞2，3*

（1.广西民族大学海洋与生物技术学院/广西微生物与植物资源利用重点实验室/广西高校化学与生物转化过程重点实验室，南宁530008；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室/广西农业科学院/广西甘蔗遗传改良重点实验室/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/中国农业科学院甘蔗研究中心，南宁530007；3.广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004）

为了优化适用于甘蔗叶片蛋白质的分离纯化方法与双向凝胶电泳体系，比较了3种蛋白质分离纯化方法对甘蔗叶片蛋白质的SDS-PAGE电泳图谱、蛋白质提取率以及双向凝胶电泳的影响,同时优化了双向电泳条件。结果显示，SDS提取法的SDS-PAGE电泳图谱中条带较少，蛋白质沉淀杂质多,效果差；三氯乙酸/丙酮沉淀法蛋白质沉淀得率高，但沉淀复溶性差，蛋白质溶液浓度低，难于满足双向电泳大胶的高上样量要求；酚抽提法蛋白质沉淀得率虽低，但沉淀纯度高、复溶性好，蛋白质溶液浓度高，是适合双向电泳分离纯化甘蔗叶片蛋白质的理想方法。酚抽提法蛋白质双向凝胶电泳合适的胶条pH范围为4～7，17 cm大胶合适的上样量为800 μg，平均可分离出954个蛋白点。

甘蔗叶片；蛋白质纯化；SDS-PAGE；双向凝胶电泳；条件优化

蛋白质组学（proteomics）是后基因组时代系统研究生物功能基因的有效手段[1-2]，而双向凝胶电泳（twodimensional protein electrophoresis，2-DE）是蛋白质组学研究中最基本的实验技术[3-4]。该技术自1975年由O’Farrell[5]首次建立以来，目前已成为从复杂系统中分离检测蛋白的有效手段，其主要包括蛋白质的提取纯化、等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）、SDS-PAGE、凝胶染色、图像分析等步骤。其中蛋白质的提取尤为重要,尤其植物组织中富含的色素、酚等次生代谢产物会对蛋白质的提取与电泳分离产生严重干扰[6-8]。适于双向电泳分离的植物组织蛋白质提取方法主要有十二烷基硫酸钠（SDS）提取法、三氯乙酸（trichlomacetic acid，TCA）/丙酮沉淀法和酚抽提法等[9-11]，但不同的材料以及不同的研究目标需要采取不同的蛋白质提取与分离策略。因此，不同材料或特殊目标需要针对不同来源的样品进行蛋白质提取与双向凝胶电泳条件的优化。

甘蔗是广西的特色与优势作物，甘蔗产业是广西的支柱产业，目前有关甘蔗蛋白质组学研究报道还较少，因此本实验采用3种不同方法提取蛋白质，并进行SDS-PAGE电泳与双向电泳分析，优化甘蔗叶片蛋白质双向凝胶电泳技术体系，为进一步开展甘蔗叶片蛋白质组学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗（Saccharum officinarum L.）品种新台糖22号，温室育苗至5～6片叶时采取+1叶于-80℃保存备用。

IPG胶条（IPG Strip）、IPG buffer为Bio-Rad公司产品；3-[（3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巯基乙醇购自Sigma公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、碘乙酰胺、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺（TEMED）、过硫酸铵（Ammonium persulfate，AP）、硫脲、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、十二烷基硫酸钠（SDS）、尿素、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）等均购自AMRESCO公司；考马斯亮蓝G250、甘氨酸、40%丙烯酰胺单体、Tris-饱和酚（pH 7.5）、甘油、低熔点琼脂糖等试剂均购自上海生工生物技术服务有限公司。

双向电泳系统为：等电聚焦仪Protean IEF Cell，电泳仪PowerPac Universal Power Supply（Bio-Rad）、电泳槽Mini PROTEAN Tetra Cell（Bio-Rad）、Protein II（Bio-Rad）；凝胶扫描仪GS-800 Calibrated Densitometer（BIO-RAD），图像分析软件为Quantity One和PDQuest（Bio-Rad）；离心机为5810R（德国Eppendorf）和Mikro 200R（德国HETTICH）。

1.2 总蛋白的提取与分离纯化

SDS提取法：准确称取2 g甘蔗叶片，迅速用液氮研磨成粉状，将粉状样品转入50 mL预冷离心管中，加入10 mL预冷提取液（0.25 mol/L Tirs-HCl pH 7.5，50 mmol/L EDTA-Na2，2%SDS，2%PVPP，2%DTT），涡旋、振荡处理5 min，12000 r/min，4℃离心20 min后取上清，上清中加入1/4体积50%TCA/丙酮溶液，4℃沉淀2 h以上，12000 r/min，4℃离心20 min后弃上清，沉淀用4倍体积的冷丙酮洗涤3次，冷冻干燥后于-80℃保存备用。

三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法：准确称取2 g甘蔗叶片液氮速冻，迅速用液氮研磨成粉状，加入0.2 g PVPP，分次加入-20℃预冷的10%TCA/丙酮溶液15 mL冰浴研磨匀浆10 min后转移至50 mL离心管，-20℃静置过夜，4℃，12000 r/min离心20 min取沉淀，沉淀用冷丙酮（含0.07%β-巯基乙醇）洗涤1～2次，沉淀冷冻，冻干燥后于-80℃保存备用。

酚抽提法参照文献[12]采用Tris-饱和酚萃取蛋白质，然后用乙酸铵的甲醇溶液沉淀酚层中的蛋白质。

1.3 蛋白质溶解与定量

将蛋白质干粉加入2.5 mL蛋白溶解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，1%IPG buffer，40 mmol/ L DTT，5 mmol/L EDTA-Na2，1 mmol/L PMSF）复溶振荡让其充分分散，于30℃水浴超声溶解1 h，然后12000 r/min，20 min离心取上清，采用Bradford法[13]进行定量测定。

1.4 电泳

1.4.1 SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳采用4%的浓缩胶，12%分离胶，凝胶厚度为1 mm，电极缓冲液为Tris-甘氨酸（pH=8.3）系统。样品溶液按一定比例与上样缓冲液（15%甘油，2%SDS，62.5 mmol/L Tris-HCl pH6.8，5%β-巯基乙醇，0.001%溴酚兰）混合，振荡混匀，95℃加热5 min使蛋白质变性，离心10 min后取上清上样，上样量20 μg，恒流模式（20 mA/gel）电泳，电泳完毕采用考马斯亮蓝染色法进行染色。待充分染色观察到明显的条带条纹时可终止染色。脱色液用20%甲醇和10%乙酸进行脱色，在此过程中不断更换脱色液，把胶面的底色全部脱掉，至条带条纹清晰明朗而止。

1.4.2 双向电泳将蛋白质溶解液与上样水化缓冲液（8 mol/L尿素、2%CHAPS、2%IPG buffer、40 mmol/L DTT和0.001%溴酚蓝）混合，调节上样体积为125 μL（7 cm小胶）和300 μL（17 cm大胶），混匀后将上样液加入到等电聚焦盘，然后将IPG胶条胶面向下放入槽内，加适量覆盖油覆盖胶条表面后进行等电聚焦（IEF）电泳，聚焦温度为18℃，每根胶条限流50 μA。聚焦结束后，分别用含2%DTT和2.5%的碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液（6 mol/L尿素，2%SDS，0.375 mmol/L Tris-HCl pH8.8，20%甘油）平衡胶条各15 min后将胶条转移到12%的SDS-PAGE凝胶上方，进行第二向SDS-PAGE恒流模式（20 mA/gel）电泳，电泳完毕采用考马斯亮蓝染色法进行染色。

1.5 凝胶图像处理与分析

脱色后的凝胶用台式凝胶扫描仪GS-800 Calibrated Densitometer（BIO-RAD）进行数字化处理。扫描图像与凝胶大小比例为1∶1。应用Quantity Qne软件对SDS-PAGE电泳图谱进行处理与分析，用PDQuest 8.0分析软件分析处理双向电泳图谱。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白质提取方法的比较

3种方法提取的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱如图1所示，Quantity Qne软件分析可知，SDS提取液提取法、TCA/丙酮沉淀法以及酚抽提法可分离出的蛋白质条带分别为18条、28条、与29条。SDS提取液提取法直接提取法电泳图谱中条带较少且比较模糊，说明样品中影响电泳的盐离子浓度较高或蛋白质有所降解。

而TCA/丙酮沉淀法以及酚抽提法的SDS-PAGE电泳效果较好，所得蛋白质条带数目相近，条带分布也相似，TCA/丙酮沉淀法在分离分子量为18.4～25.0 kμ范围内的蛋白质效果稍好于酚抽提法，但各方法所获得的蛋白质沉淀质量、沉淀溶解性与提取率之间差别较大。

图1 不同蛋白质提取方法的甘蔗叶蛋白质12%分离胶SDS-PAGE电泳图谱Fig.1 The protein profiles produced by 12%separating gels of SDS-PAGE,extracted from sugarcane leaves with different methods

表1 不同蛋白质提取方法对甘蔗叶蛋白质提取效果比较Table 1 Comparison of sugarcane leaf protein extraction results with different methods

如表1所示，SDS提取法蛋白质沉淀颜色深，状态粘稠，杂质多，给后续的沉淀洗涤与纯化带来困难；TCA/丙酮沉淀法蛋白质沉淀为黄白色粉状、沉淀得率显著高于SDS提取法与酚抽提法（P＜0.05），但含有许多不溶解性杂质；而酚抽提法沉淀得率与SDS提取法无显著差异（P＞0.05），但蛋白质沉淀为白色粉状，杂质少，有利于后续的复溶。

采用同量的溶解液溶解蛋白质沉淀，酚抽提法获得的蛋白质溶液浓度显著高于SDS提取法与TCA/丙酮沉淀法（P＜0.05），浓度达到（5.13±0.24）μg/μL，可以满足双向电泳上样量要求；TCA/丙酮沉淀法获得的蛋白质溶液浓度最低，浓度为酚抽提法的56.7%，说明采用TCA/丙酮沉淀法获得的蛋白质沉淀得率虽然高，但沉淀杂质多、复溶性差。

从蛋白质SDS-PAGE电泳图谱、蛋白质沉淀质量、状态、复溶性以及蛋白质提取率综合分析，酚抽提法是较理想的方法。

2.2 不同蛋白质提取方法的双向电泳图谱比较

图2为TCA/丙酮法与酚抽提法提取的蛋白质采用7 cm胶条，上样量为200 μg条件下的双向电泳图谱，图谱经过PDQuest 8.0分析软件分析，TCA/丙酮沉淀法与酚抽提法分别检测出232±11与409±13个点。

TCA/丙酮沉淀法作为一种双向电泳蛋白质提取的常用方法，获得的蛋白质经过洗涤除杂、复溶后获得的双向电泳图谱的分离效果也基本可行，但由于蛋白质的复溶性差，造成蛋白质丢失严重，检出蛋白点只有酚抽提法的56.7%。所以酚抽提法是适合于甘蔗叶蛋白质双向电泳分析的蛋白质提取方法。

图2 TCA/丙酮法与酚抽提法甘蔗叶蛋白质双向电泳分析Fig.2 2-DE analysis of protein from sugarcane leaves extracted with TCA/acetone precipitation and phenol extraction methods a:TCA/丙酮法TCA/acetone precipitation；b：酚抽提法phenol extraction

2.3 酚抽提法双向电泳分离甘蔗叶蛋白质体系优化

IPG胶条可以在很广的pH范围进行IEF电泳，从pI值为3的强酸性蛋白质到pI值为10的强碱性蛋白质，有不同的pH范围可供选择。实验将酚抽提法纯化的蛋白质采用7 cm长，pH 3～10的胶条进行双向电泳分离，结果如图3所示。从图3中可以看出，酚抽提法纯化的蛋白质等电点（pI）主要集中分布在4～7的范围，由于采用了pH 3～10的胶条，造成蛋白质斑点拥挤，分离效果差，蛋白质聚集拖尾严重，而采用pH 4～7窄pH范围的胶条分离则改善了蛋白质的分离效果（图3b）。

IEF电泳是在超高压下蛋白质不断移动聚焦到其等电点处。IEF电泳参数的设置直接影响到聚焦效果。表2是针对7 cm与17 cm胶条优化设置的等电聚焦电泳参数。

图3 酚抽提法甘蔗叶蛋白质7 cm长不同pH范围胶条的双向电泳分析Fig.3 2-DE analysis of proteins from sugarcane leaves in 7 cm and pH 3-10 IPG strip by phenol extraction method

表2 IPG胶条的等电聚焦电泳参数Table 2 Parameters of the isoelectric focusing (IEF) electrophoresis of immobile pH gradients (IPG)

图4 酚抽提法提取的甘蔗叶蛋白质在17 cm长，pH 4～7的胶条双向电泳分析Fig.4 2-DE analysis of proteins from sugarcane leaves extracted with phenol extraction method in a 17 cm long IPG strip with pH 4～7

参数设置中采用50 V低电压进行主动水化，有利于干胶条的充分溶胀以及样品进入胶条。一次典型的IEF电泳，需要经过一系列的升压过程，直至达到预设电压。经过实验摸索，采用多步升压除盐，可保证样品聚焦时能达到预设电压，聚焦充分。

有关载样量，7 cm长的小胶合适的载样量在200 μg左右，过高的载样量引起蛋白点分离效果差，而上样量过低，也引起可检测的蛋白质点数减少。在7 cm长的小胶条件摸索的基础上，采用17 cm长，窄pH范围（pH 4～7）的大胶进行实验，大胶的载样量在800 μg左右合适。

优化条件下所获得的双向电泳图谱如图4所示。图谱经过PDQuest 8.0分析软件分析可检测出的蛋白点数为954±13个。从图谱中可以清晰地显示酚抽提法分离甘蔗叶片蛋白质分布情况，分子量主要集中在15 kDa~100 kDa范围。

3 讨论

蛋白样品的提取是进行蛋白质组学分析的先决条件，只有得到了高纯度的蛋白质才能为后面的实验打下良好的基础。本研究比较了SDS提取法、TCA/丙酮提取法和酚抽提法3种蛋白样品的提取方法。

综合比较，SDS提取液提取法直接提取法电泳图谱中条带较少且比较模糊，蛋白质在提取过程中可能有损失和降解。另外，蛋白质沉淀颜色深，状态粘稠，可能含有较多的盐、多糖、色素、酚、醌等杂质，不适合双向电泳。TCA/丙酮沉淀法是提取植物蛋白常用的一种方法，该法可降低蛋白质样品中的盐离子，并能抑制蛋白酶的活性[14]。盐是双向电泳中最常见的一种杂质[15]，样品溶液中盐离子浓度过高，引起等电聚焦电压偏低，影响等电聚焦。TCA/丙酮沉淀法虽能有效地去除蛋白质样品中的盐离子，但对多糖、色素等杂质的去除欠佳，所以配合添加PVPP吸附剂，可减少植物色素等次生代谢物质的干扰。TCA/丙酮沉淀法获得蛋白沉淀得率虽高，但沉淀复溶性差，导致蛋白质溶液浓度低，蛋白质丢失严重，难于满足双向电泳大胶的高上样量要求。酚抽提法采用Tris-饱和酚将蛋白质萃取到酚相，而盐、核酸、色素、酚和多糖等可溶性物质则进入水相，然后用乙酸铵的甲醇溶液沉淀酚层中的蛋白质，从而可以有效去除样品中的可溶性干扰杂质[16]。所以蛋白质沉淀得率虽然低，但沉淀纯度高、复溶性好，蛋白质溶液浓度高，是适合双向电泳分离甘蔗叶片蛋白质的理想方法。

另外，高电压是等电聚焦成功的关键，由于样品提取与溶解过程中，一些盐离子、糖分、核酸类小分子的干扰引起等电聚焦电压偏低[17]，聚焦不充分，图谱出现水平拖尾现象。本研究中的酚抽提法可以较好地除去干扰物质，同时配合等点聚焦参数设置较长的低压脱盐步骤，使得样品等电聚焦电压达到预设值，解决了图谱出现水平拖尾的现象。上样量的高低也直接影响图谱的分辨率与分离效果。上样量过高，等电聚焦中容易引起蛋白的聚集沉淀，盐离子及其它杂质含量提高，影响等电聚焦，且上样量过高可导致电泳图谱蛋白点重叠，而上样量过低则导致低丰度蛋白点的检测灵敏度下降，影响软件的分析和识别。

本研究中通过对甘蔗蛋白样品的提取方法比较，筛选出适合双向电泳分离甘蔗叶片蛋白质的酚抽提法，并优化了胶条pH范围、上样量、等电聚焦参数等条件。结果显示，采用酚抽提法纯化的蛋白质进行双向电泳合适的胶条pH范围为4～7，17 cm长大胶上样量为800 μg，平均可分离出954个蛋白点。

[1]PANDEY A,MANN M.Proteomics to study genes and genomes[J].Nature,2000,405(6788):837-846.

[2]WICKWARE P,SMAGLIK P.Proteomics technology character references[J].Nature,2001,413(6858):869-875.

[3]INAGAKIN,KATSUTA K.Large gel two-dimensional electrophoresis:improving recovery of cellular proteome[J].Curr.Proteom., 2004,100(1):35-39.

[4]HOVING S,VOSHOL H,OOSTRUM J V.Towards high performance two-dimensional gel electrophoresis using ultrazoom gels[J]. Electrophoresis,2000,21(13):2617-2621.

[5]O’FARRELL P H.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J].J.Biol.Chem.,1975,250(10):4007-4021.

[6]CANOVAS F M,DUMAS-GAUDOT E.Plant proteome analysis[J].Proteomics,2004,4(2):285-298.

[7]SHAM M M,RIEDERER B M.Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis[J].Proteomics,2003,3(8):1408-1417.

[8]LILLEY K S,DUPREE P.Plant organelle proteomics[J].Curr Opin Plant Biol,2007,10:594-599.

[9]SARAVANAN R S,ROSE J K C.A critical evaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues[J].Proteomics,2004,4(9):2522-2532.

[10]CARPENTIER S C,WITTERS E,LAUKENS K,et al.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues:An evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics,2005,5(10):2497-2507.

[11]AGRAWAL G K,YONEKURA M,IWAHASHI Y,et al.System,trends and perspectives of proteomics in dicot plants.Part I, technologies in proteome establishment[J].Journal of Chromatography B,2005,815(1-2):109-123.

[12]ZHOU G，YANG L T，LI Y R，et al.Proteomic analysis of osmotic stress-responsive proteins in sugarcane leaves[J].Plant Mol. Biol.Rep.,2012,30:349-359.

[13]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal.Biochem.,1976,72(1-2):248-254.

[14]TSUGITA A，KAMO M.2-D electrophoresis of plant proteins[J].Methods Mol.Biol.,1999,112:95-97.

[15]GORG A,WEISS W,DUNN M J.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[J].Proteomics,2004,4(12): 3665-3685.

[16]WANG W,SCALI M,VIGNAN R,et al.Protein extraction for two-dimensional electrophoresis from olive leaf,a plant tissue containing high levels of interfering compounds[J].Electrophoresis,2003,24(14):2369-2375.

[17]YAO Y,YANG Y W,LIU J Y.An efficient protein preparation for proteomic analysis of developing cotton fibers by 2-DE[J]. Electrophoresis,2006,27(22):4559-4569.

Comparison of Three Extraction and Purification Approaches and Optimization of Two Dimensional Electrophoresis System for Proteins from Sugarcane Leaves

ZHOU Gui1,2,ZOU Cheng-lin2,QIU Li-Hang2,3,LIU Xiao-xia1,MAO Jiang-jiang1,YANG Li-tao2,3,LI Yang-rui2,3*
(1.School of Marine Sciences and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities/Guangxi Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical Resources/Key Laboratory of Chemical and Biological Transforming Process in Universities of Guangxi, Nanning 530008;2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory/Guangxi Academy of Agricultural Sciences/ Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi),China Ministry of Agriculture/Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences;3.College of Agriculture/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources,Guangxi University,Nanning 530004)

Proteins in sugarcane leaves were extracted and purified by using three methods i.e.SDS extraction methods,trichloroacetic acid(TCA)/acetone precipitation and phenol extraction.Their productivity and profiles were assessed by means of SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis.The conditions of two-dimensional electrophoresis were also optimized.The results showed that the result of SDS extraction method was poor because of less bands and impurity in protein precipitation.For TCA/acetone precipitation method,the productivity of protein precipitation was high,but it was difficult to re-resolve the precipitated protein,and the resulted concentration of proteins was too low to match the normal requirement of 2-DE analysis.The phenol extraction method was found to be the best for high purification and high protein concentration.The optimized conditions for two-dimension electrophoresis of phenol extraction method was pH 4~7 for 17 cm dry strip with 800 μg protein loading amount,which produced 954 spots in average.

sugarcane leaves;protein purification;SDS-PAGE;two-dimensional electrophoresis

S566.1；Q51

A

1007－2624（2017）02－0001－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.001

2016-10-13

广西自然科学基金项目（2010GXNSFA013101，2011GXNSFF018002）；广西农科院团队项目（桂农科2011YT01）。

周桂（1969-），女，博士，教授，从事植物生物化学研究。E-mail：zhouguigx@hotmail.com

李杨瑞（1957-），男，博士，教授，博士生导师，主要从事甘蔗栽培、育种和生物技术研究。E-mail：liyr@gxaas.net