鸡源HPI+大肠杆菌的鉴定及黄连连翘对其的联合抑制作用研究

王艳萍，董林，郭时金，3，徐倩倩，苗立中，李风叶，莫玲，谢金文，沈志强

(1．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600;2．山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600; 3．山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州256600;4．山东省滨州市畜牧兽医局，山东滨州256600)

鸡源HPI+大肠杆菌的鉴定及黄连连翘对其的联合抑制作用研究

王艳萍1，2，3，董林1，郭时金1，3，徐倩倩1，2，3，苗立中1，李风叶4，莫玲1，谢金文1，沈志强1

(1．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600;2．山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东滨州256600; 3．山东绿都安特动物药业有限公司，山东滨州256600;4．山东省滨州市畜牧兽医局，山东滨州256600)

为了研究黄连和连翘对HPI+大肠杆菌的联合抑菌作用，采用PCR方法对已知血清型的9株鸡源大肠杆菌进行了HPI毒力岛携带情况检测，检测出7株HPI阳性，2株阴性;采用微量稀释法和微量棋盘法对这7株HPI+大肠杆菌进行了黄连、连翘的提取物单独与联合抑菌试验。结果表明，黄连、连翘单用时，对HPI+大肠杆菌的MIC分别为125.0 mg/mL和714 mg/mL，当两者联合使用时，黄连、连翘的MIC分别为125.0 mg/mL和89.25 mg/mL，联合抑菌指数FIC=1.125，表现出了无关作用。提示，黄连、连翘提取物不适合作为药物对其进行抑菌试验。

黄连;连翘;联合抑菌;HPI+大肠杆菌

随着畜牧业和动物医疗事业的发展，社会各界对严格使用抗生素的呼声越来越高。毒力岛最早发现于耶尔森菌属，因与该属菌的小鼠致死表型密切相关，故被命名为耶尔森菌强毒力岛(HPI)［1－3］，与致病性大肠杆菌的毒力进化密切相关，可水平传播［4－6］。特选取中药黄连和连翘对HPI+大肠杆菌的联合抑菌作用来筛选高效抗菌中药。

1 材料与方法

1．1 药材黄连、连翘，购自安国伊康药业有限公司;DNA Marker DL-2 000，由宝生物工程(大连)有限公司提供;0．5麦氏比浊管、MH琼脂、MH肉汤，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1．2 菌株大肠杆菌O2标准株由安徽农业大学馈赠，临床分离的大肠杆菌血清型分别为O2、O112、O91、O11、O46、临床分离20号菌、O109和O45。由山东省滨州畜牧兽医研究院分离鉴定。

1．3 仪器RE－52AAA旋转蒸发器，上海嘉鹏科技有限公司;SH－B 95A型循环水式多用真空泵，上海豫康科教仪器设备有限公司;ST16R离心机，美国ThermoFisher ST 16R;台式小型离心机，Sigma; PCR仪，TAKARA TP100。

1．4 试验方法

1．4．1 黄连、连翘的提取及浓缩称取30 g黄连，粉碎，后加入10倍、8倍、8倍水，煎煮提取3次，每次2 h，3 000 r/min离心10 min，－0．08 Mpa浓缩。称取25 g连翘，粉碎，加入10倍、8倍40%乙醇，超声提取2次，每次2 h，3 000 r/min离心10 min，－0．08 Mpa浓缩。

1．4．2 HPI+菌株的鉴定大肠杆菌基因组DNA制备:分别挑取琼脂平板上的O2标准株、O2、O112、O109、O45、O91、O11、O46和临床分离20号菌单个菌落，接种LB液体培养基，培养10 h后，10 000 r/min离心2 min收集菌体，提取细菌基因组DNA，具体操作按百泰克生物技术(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)步骤进行。

引物设计与合成:根据GenBank中已发表的禽源大肠杆菌高致病性毒力岛irp2基因序列，选取强保守性区段，设计如下特异性引物，用于irp2特异性序列PCR扩增，理论跨度约为521 bp。引物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。

表1 irp 2引物设计

PCR扩增程序:以制备的大肠杆菌DNA为模板，以设计的PF－fyuA、PR－fyuA为引物进行PCR扩增，组合优化PCR反应体系见表2。

表2 PCR反应体系

确定最佳PCR程序:95℃4 min，94℃1 min，55℃40 s，72℃45 s，30个循环，72℃10 min，4℃终止。PCR程序结束，取5．0 μL产物用1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察结果。

1．4．3 制备HPI+大肠杆菌菌液将已经纯化并鉴定为HPI+的大肠杆菌菌株，挑取平板上的单菌落，接种至肉汤培养基中，置37℃培养箱中，过夜培养，稀释至每毫升含细菌1．5×105CFU。

1．4．4 测定黄连、连翘最低抑菌浓度以微量稀释法进行:取U形底96孔板，在第1～9孔中每孔加入MH肉汤50 μL，第1孔加入药物原液50 μL，混合均匀后，依次倍比稀释至第9孔，自第9孔中吸取50 μL弃去。第10孔加入MH肉汤100 μL作为空白对照，第11孔加入药物原液100 μL作为药物对照，第12孔为菌液对照，加入MH肉汤50 μL，第1至9孔和12孔加入以上制备好的菌液，每孔50 μL，加完液后盖上盖，振荡混匀，置入垫有湿润纱布的方形盘内，于36℃培养18h～24 h后，观察结果。

表3 微量稀释法药物加入方法

1．4．5 黄连、连翘联合抑菌效果的测定微量棋盘稀释法，基本方法同微量稀释法。用灭菌后的96孔微孔板，在第1～6行沿X轴方向(从左到右)每孔中依次加入:普通肉汤，1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC的黄连药液各25 μL，以同样的方法在第A～F列沿Y轴方向(从上到下)每孔中依次加入8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC的连翘提取物液、普通肉汤各25 μL，将两药混合均匀。然后加入制备好的菌液50 μL，使最终抗菌药物浓度与计划稀释度相同，加液完毕，盖上盖，振荡混匀，放入垫有湿纱布的方盘内，36℃培养18 h～24 h，观察结果。棋盘稀释法药物加入方法按表3，并设立平行样。两种药物组合后每孔的最终浓度则为原药物浓度的1/4。

1．4．6 结果判定标准将U型底96孔聚乙烯微孔板放置于黑色背景下观察，孔底如有圆点样的浑浊沉淀物表明有细菌生长，孔内液体如不显浑浊表明细菌被抑制生长。细菌的生长完全被抑制的抗菌药物最低的稀释度即为该药物的MIC值。

2 结果

2．1 黄连、连翘提取结果将黄连提取液浓缩至30 mL，浓度为1．0 g/mL，连翘浓缩至35 mL，0．71 g/mL。

2．2 HPI+大肠杆菌筛选结果共筛选出6株irp2阳性菌株，分别为临床分离株大肠杆菌O2、O112、O91、O11、O46、临床分离20号菌和大肠杆菌O2标准菌株，O109和O45未检出irp2基因。结果如图1所示。

图1 HPI检测PCR电泳结果

2．3 最小抑菌浓度(MIC)

2．3．1 单药的最小抑菌浓度结果显示，黄连单用时的对10株细菌的最小抑菌浓度均为62．5 mg/mL，连翘单独使用时的最小抑菌浓度均为714 mg/mL，可见，相同条件下，黄连的抑菌作用强于连翘。

2．3．2 黄连提取物与连翘提取物的联合抑菌浓度两药联合使用时，黄连提取物的MIC为62．5 mg/mL;连翘提取物的MIC为89．25 mg/mL;可见，两药联用后，黄连的MIC和单用时相同，连翘的MIC降为原来的1/8。

黄连和连翘的联合抑菌指数为:FIC指数=A药联合时的MIC/A药单测时的MIC+B药联合时的MIC/B药单测时的MIC=125mg/mL/125mg/mL+ 89．25mg/mL/714mg/mL=1．125，说明连翘和黄连为无关作用。评价标准:FIC指数＜0．5为协同作用;0．5～1为相加作用;1～2为无关作用;＞2为拮抗作用。注:A:连翘，B:黄连。

表4 黄连与连翘提取物对HPI+大肠杆菌体外联合MIC

3 讨论

黄连为毛莨科植物，黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎，秋季采挖，除去须根和泥沙，干燥，撞去残留须根。具有清热燥湿，泻火解毒之功效。连翘为木犀科植物连翘的干燥、成熟的果实，具有清热解毒、消热散结的功效。黄连和连翘对大肠杆菌均有抑菌效果，2010年李国旺［7］等采用药敏纸片法做了黄连和连翘对鸡大肠杆菌的体外抑制试验，结果发现，两者对鸡大肠杆菌均有抑制作用，且黄连抗菌活性强于连翘。这与本试验结果一致。

胡文举［8］发现黄连素对1x105CFU浓度的4株大肠杆菌的MIC分别为0．75、0．5、0．375 mg/mL和1．0 mg/mL;陈志华［9］等做了黄连素对大肠杆菌O78和临床分离株的MIC，结果为384 μg/mL和512 μg/mL。白云娥［10］等在2003年对以试管倍比稀释法对连翘做了体外抑菌试验，结果发现，连翘水提物对大肠杆菌的MIC为73．63 mg/mL，与本文的试验结果稍有差异，这或许与所采取的试验方法有关。

试验表明，黄连水提物和连翘水提物虽各自对大肠杆菌有抑制作用，但两者联合却呈现出不相关作用，说明两者在用作抗菌药物时不适合配伍使用，这与王婷婷［11］研究的结果相冲突，这可能与提取方法有关，本文中的连翘提取方法为超声，而王婷婷所用方法为对黄连－连翘药对进行索氏提取，且提取溶媒均为无水乙醇，不同的提取方法和提取溶媒提取出不同的药物成分，这或许是两者的区别所在。

从以上结果可知，黄连、连翘的抑菌作用对不同血清型的大肠杆菌没有选择性，仅从抗菌作用这方面来说，两者呈现出无关作用，但要从机体方面来说两者是否配伍使用，有待于更深入的研究。

［1］金文杰，郑志明，王倩倩，等．禽源性大肠杆菌HPI irp2基因序列的扩增及比较［J］．扬州大学学报:农业与生命科学版，2005，26(3):5－7．

［2］Carniel E，Guilvout I，Prentice M．Characterization of a large chromosomal/high－pathogenicity island0in biotype1BYersinia entero-colitica［J］．J Bacteriol，1996，178(23):6743－6751．

［3］Mokracka J，Koczura R，Kaznowski A．Yersiniabactinand other siderophores produced by clinical isolates of Enterobacter spp．And Citrobacter spp［J］．FEMS Immunology and Medical Microbiology，2004，40(1):51－55．

［4］Schubert S，Rakin A，Fischer D，et al．Characterization of the integration site ofYersiniahigh－pathogenicity island inEscherichia coli［J］．FEMS Microbiol Lett，1999，179(2):409－414．

［5］Rakin A，Urbitsch P，Heesemann J．Evidence for two evolutionary lineages of highly pathogenicYersiniaspecies［J］．J Bacteriol，1995，177(9):2292－2298．

［6］Rakin A，Schubert S，Guilvout I，et al．Local hopping of IS3 elements into the A+T－rich part of the high－pathoge－nicity island inYersinia enterocolitica1B，O:8［J］．FEMS Microbiol Lett，2000，182(2):225－229．

［7］李国旺，赵恒章，苗志国．5种中药对鸡大肠杆菌的体外抑菌试验［J］．贵州农业科学，2010，38(10):141－143．

［8］胡文举，宋艳画，吴伶俐．黄连素和黄芪多糖对鸡源大肠杆菌的体外联合抑菌作用［J］．中兽医学杂志，2013(6):8－10．

［9］陈志华，陈晓生，缪小群，等．黄连素与抗菌药物联用对大肠杆菌体外抗菌活性的影响［J］．中国兽医杂志，2004，40(12): 36－37．

［10］白云娥，漆小梅，杨国红，等．连翘提取物的体外抗菌试验［J］．山西医科大学学报，2003，34(6):506－507．

［11］王婷婷．黄连、连翘协同抑菌配方优化及保鲜应用研究［D］．泰安:山东农业大学，2011．

Identification of E．coli HPI+and Associated Bacteriostasis of Rhizoma Coptidis and Fructus Forsythiae research

WANG Yan-ping1，2，3，DONG Lin1，GUO Shi-jin1，3，XU Qian-qian1，2，3，MIAO Li-zhong1，LI Feng-ye4，MO Ling1，XIE Jin-wen1，SHEN Zhi-qiang1
(1．Binzhou animal Science and Veterinary Medicineinstitude，Binzhou 256600，China;2．Shandong Binzhou Research，development and promotion center for Livestock and poultry propolis vaccine，Binzhou 256600，China; 3．Shandong lvduante Animal Medicine Co．，Ltd，Binzhou 256600，China; 4．Shandong province Binzhou city Animal Science＆Veterinary Medicine office，Binzhou 256600，China)

To study the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae when used in combination on HPI+E．coli，polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the HPI virulence island of the 9 strains E．coli of known serotype from chickens 7 strains of HPI was detected positive and 2 strains were negative．Bacteriostatic test alone and in combination of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae extract were performed on seven HPI+E．coli by microdilution method or microdilution checkerboard．The results showed that the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 714 mg/mL on HPI+E．coli when used alone．The MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 89．25 mg/mL when used in combination，and Joint antibacterial index was FIC=1＜1．125＜2

Coptis chinensis;Forsythia suspense;Associated bacteriostasis;Escherichia coli of HPI+

SHEN Zhi-qiang

S852．61

A

0529-6005(2017)01-0056-04

2016－03－18

山东省自然科学基金资助项目(ZR2014CQ012);国家自然科学基金资助项目(31402243);山东省家禽产业创新团队滨州综合试验站(SDAIT－11－16)

王艳萍(1979-)，女，兽医师，硕士，从事动物疫病及综合防治研究工作，E-mail:xiaowangyanping213@163.com

沈志强，E-mail:1297986799@qq.com