美洲红点鲑嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

巴翠玉，张雅斌，杜晓燕，张林波，赵福广，张培军，李月红

(1．吉林农业大学，吉林长春130118;2．吉林省水产科学研究院，吉林长春130033; 3．吉林省卫生监测检验中心，吉林长春130000)

美洲红点鲑嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

巴翠玉1，张雅斌2，杜晓燕2，张林波1，赵福广1，张培军3，李月红1

(1．吉林农业大学，吉林长春130118;2．吉林省水产科学研究院，吉林长春130033; 3．吉林省卫生监测检验中心，吉林长春130000)

为预防和治疗在美洲红点鲑中暴发嗜水气单胞菌病提供实验依据。从患病美洲红点鲑的鳃及肠等病灶部位分离到一株细菌，经回归试验均出现与自然病例相似的症状，并分离到革兰染色和生理生化特性结果与原菌株相同的细菌。结果表明，该菌为短杆状，两端钝圆的革兰阴性菌，与D－葡糖酸、丙二酸和葡萄糖等反应呈阳性，而与黏菌素、七叶苷和L－阿拉伯糖等反应呈阴性，结合16S rRNA基因序列分析结果，该菌与嗜水气单胞菌的亲缘关系最近，鉴定为嗜水气单胞菌。对其进行药敏试验，结果对氨苄西林、环丙沙星和头孢唑啉等药物表现出耐药，对阿米卡星和亚胺培南等药物敏感。本试验首次从美洲红点鲑中分离出嗜水气单胞菌，并得到16种高度敏感的药物，同时阐明了嗜水气单胞菌在美洲红点鲑中的发病症状。

美洲红点鲑;嗜水气单胞菌;分离鉴定;药敏试验

美洲红点鲑，俗称七彩鲑，属鲑形目、鲑科、红点鲑属，主要分布在加拿大东部和美国东北部的大部分水域，2001年引进我国［1－2］。因具有生长速度快、产量高、抗病能力强、肉质好等特点，在我国被许多地方养殖。关于红点鲑属鱼类的研究主要针对于生物学、人工繁殖和苗种培育、成鱼养殖等方面［3］，对于疾病方面的研究较少，但随着养殖规模及数量的不断增加，鱼病的暴发率也不断升高，尤其是细菌性疾病病发率更高，给养殖户带来了重大的经济损失，阻碍养殖业的持续健康发展。因此，加强对病害的检测，随时掌握病害发生情况，迅速制定有效的防控措施，对养殖业的健康发展具有重要意义。2015年10月，吉林省某渔场的美洲红点鲑发生了烂鳃病，鱼发病后死亡率较高。本试验对发病美洲红点鲑进行了病原菌的分离鉴定，分离到一株嗜水气单胞菌，经回归试验证实该菌株具有较强致病力，通过形态特征、主要理化特性及分子生物学手段等对该菌进行鉴定，同时对病原菌进行药物敏感性试验，为预防和治疗嗜水气单胞菌引起的鲑科类疾病提供了一定的参考依据。

1 材料与方法

1．1 美洲红点鲑来源自然患病的美洲红点鲑采自吉林省某渔场，均尾重约600 g左右;人工感染用的健康美洲红点鲑由青龙养殖场提供，均尾重约300 g左右。

1．2 发病特征患病鱼肛门红肿，体表完整在水中不集群，游动缓慢，鱼体上浮，摄食量明显下降;鳃盖向外张开，呈镊子状，各鳍末端色素减退，呈浅白色;剖检发现，鳃丝肿胀，末端部分糜烂，周围带有黏液，鳃丝呈灰褐色、“扫帚状”;胆囊肿大呈墨绿色;后肠充血，肠腔无内容物，含浅黄色的黏液，肠壁黏膜呈现紫红色。

1．3 试验仪器及试剂150G全温振荡培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温鼓风干燥箱、超净工作台、革兰染色试剂盒、法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统、麦康凯琼脂培养基、LB培养基、生理盐水、酶等。

1．4 方法

1．4．1 病原菌的分离与培养在无菌的超净工作台内将具有典型自然发病症状的濒死美洲红点鲑，用75%酒精棉球擦拭体表，无菌操作取其鳃和肠等病灶部位并制成匀浆，接种到麦康凯琼脂平板上，28℃培养24 h后观察菌落生长状态。挑取形态一致的优势菌群进行纯培养，待菌落形态生长一致时，挑取单菌落用80%甘油对其进行菌落的保藏，为后续试验做准备。

1．4．2 病原菌的鉴定

1．4．2．1 细菌形态观察将分离菌接种于培养基平板上，置于28℃培养12 h，取菌体涂片，革兰染色后用光学显微镜观察菌体形态和染色特征。

1．4．2．2 生化鉴定用法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行对其鉴定，鉴定板为革兰阴性菌鉴定板，结合生物梅里埃公司的API－细菌鉴定系统API20E进行生化反应测试。试验周期结束后观察试验结果并分析。

1．4．2．3 分子生物学鉴定及系统发育树的构建

PCR模板DNA制备，按照文献［4］所示方法提取细菌DNA，利用Primer 5软件设计扩增16S rRNA基因所用引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其上、下游引物序列分别为:P1:5'－GAGGAGGAAAGGTTGATGCC－3'，P2:5'－CTTGAGTTCCCACCATTACG－3'。PCR反应体系(25 μL)为: DNA模板3 μL，10×PCR Buffer 2．5 μL，DNTP mix 1．5 μL，上、下游引物各1μL，MgCl20．5 μL，Taq DNA聚合酶0．5 μL，DEPC水补充至25 μL。PCR程序为:94℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物纯化后连接入pMD18－T载体，挑选阳性克隆交由华大基因科技服务有限公司进行测序。将所得分离菌株的16S rRNA序列在GenBank中进行BIAST比对，通过Mega5．0构建系统发育树。

1．4．2．4 药物敏感试验用法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行药敏试验，鉴定板为革兰氏阴性菌药敏板，试验周期结束后观察试验结果并分析。

1．4．2．5 回归试验试验鱼购自青龙养殖场，选用当年的美洲红点鲑。15℃水温下驯化7 d，选取体格健壮、规格整齐、游动活跃的美洲红点鲑60尾，随机分为2组，其中1组为对照组，另1组为试验组。将2组鱼同时放入相同水环境不同鱼缸中。通过腹腔注射法进行攻毒，对照组每条鱼注射无菌液体LB培养基0．2 ml，试验组每条鱼注射菌液浓度为1×107CFU/mL的液体LB培养基0．2 ml。15℃水温下饲养7 d，观察美洲红点鲑发病状况，并记录。后再对病死美洲红点鲑进行病原菌的分离及鉴定。

2 试验结果

2．1 病原菌分离及形态学观察结果从发病美洲红点鲑的病灶部位分离出1株菌株，命名为MZ－1，28℃培养24 h，在麦康凯琼脂培养基平板上菌落呈圆形、光滑湿润、边缘整齐、中央微隆起、半透明、乳白色。显微镜下可以观察到颜色为红色短杆状，两端钝圆，多数单个排列，少数成对或短链状，为革兰阴性菌。

2．2 生化鉴定结果MZ－1经过法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，可知与蔗糖、D－葡萄糖和D－甘露糖等21项指标反映呈阳性，与侧金盏花醇、组氨酸同化和D－纤维二糖等27项指标反映呈阴性，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)，确定菌株为嗜水气单胞菌。

2．3 分子生物学鉴定结果16S rRNA序列及系统发育树分析结果如图1，分离菌(MZ－1)所扩增的16S rRNA基因长度为1 500 bp;经系统发育进化树分析，发现菌株与嗜水气单胞菌的亲缘关系最近，自然聚类为一支，菌株为嗜水气单胞菌。

图1 MZ－1菌株16S rRNA PCR扩增结果(2－a)和16S rRNA系统发育树分析(2－b) M:DL-2 000 DNA Marker;1和2为PCR产物

2．4 药物敏感试验结果经过法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果如表1，药敏试验判定参照美国临床实验室标准化委员会VET01－A4标准［5］，这株菌对氨苄西林和氨苄青霉素/舒巴坦等药物表现出耐药，对哌拉西林、头孢呋辛及其他14种药物敏感。

表1 药敏试验结果

2．5 回归试验结果结果如表2，分离菌株注射感染24 h后，美洲红点鲑开始食量下降，游动缓慢。36 h后开始出现死亡。7 d后，对照组一切正常，没有发现死亡;注射菌液浓度为1×107CFU/mL液体LB培养基0．2ml的试验组中美洲红点鲑的死亡率为80%。从试验组随机挑取一条鱼剖检发现，鳃盖向外张开，呈镊子状，各鳍末端色素减退，呈浅白色;剖检发现，鳃丝肿胀，末端部分糜烂，周围带有黏液，鳃丝呈灰褐色、“扫帚状”;胆囊肿大呈墨绿色;后肠充血，肠腔无内容物，含浅黄色的黏液，肠壁黏膜呈现紫红色。取其肠和鳃等病灶部位进行细菌的再分离，对分离出的菌株进行革兰染色和生理生化鉴定，结果同从自然发病鱼体分离的株菌完全一致为嗜水气单胞菌，证明嗜水气单胞菌是该次疾病的病原菌。

表2 回归试验结果

3 讨论

本试验首次从发病美洲红点鲑的鳃和肠等病灶部位分离出1株嗜水气单胞菌。主要症状表现为体表完整，肛门红肿，鳃盖向外张开、呈镊子状，各鳍末端色素减退，呈浅白色;剖检发现，鳃丝肿胀，末端部分糜烂，周围带有黏液，鳃丝呈灰褐色、“扫帚状”;胆囊肿大呈墨绿色;病鱼后肠充血，肠腔无内容物，含浅黄色的黏液，肠壁黏膜呈现紫红色。此症状与杨斌［6］发表的虹鳟烂鳃病病原调查报告中症状相似。但除了常规的革兰染色、生理生化鉴定，PCR等常规的细菌检测方法外，我们还可以用免疫学方法对其进行检测，如凝集试验、免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验等。

对这株菌进行药敏试验，通过药物敏感试验结果发现，分离出的嗜水气单胞菌对美罗培南和阿米卡星等药物高度敏感，对氨苄西林和环丙沙星等药物表现出耐药，此结果与毛海涛［7］等从锦鲤分离出来的致病性嗜水气单胞菌药敏试验结果有些差异。可能是因嗜水气单胞菌存在很多血清型，不同鱼种间分离的致病菌株存在明显差异，即使相同鱼种也存在不同耐药性菌株，而且细菌基因组上的碱基突变、片段插入或缺失、等位基因缺失等变化都可能引起细菌耐药性的改变［8－9］。还有研究表明，外毒素、胞外蛋白酶、S层蛋白和脂多糖等这些致病因子可以受到嗜水气单胞菌群体感应系统的调节，信号分子主要是C4－HSL和C6－HSL［10－11］。因此，通过抑制致病菌的群体感应系统进而抑制其致病因子的表达将成为控制致病菌的新型治疗手段［12］。中草药和微生态制剂因具备不易残留和不易引起耐药性等优点而作为防治水产动物疾病的药物［13－14］，因此在水产病害防治中有必要加大在中草药和微生态制剂方面的投入，开发具有高效、无副作用和便捷的复方中草药以及免疫效果好、成本低并且适于批量生产的生物疫苗，真正发挥中草药和微生态制剂在水产养殖动物细菌性疾病防治中的重要作用。

随着美洲红点鲑人工养殖规模不断扩大，疾病暴发也频繁起来。因嗜水气单胞菌致美洲红点鲑发病的研究较少，一些具体的发病机制和毒力基因等方面的研究仍需要进一步的探究，本试验对吉林省嗜水气单胞菌感染美洲红点鲑发病的治疗提供了一定的试验数据和理论基础，对其养殖具有一定的指导，可为后面的研究提供一定的参考。

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Isolation，identification and drug sensitive test of Aeromonas hydrophil from Salvelinus fontinalis Crucian Carp

BA Cui-yu1，ZHANG Ya-bin2，DU Xiao-yan2，ZHANG Lin-bo1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun3，LI Yue-hong1
(1．Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2．Freshwater Fisheries Research Institute of Jilin Province，Changchun 130033;3．Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China)

One strain of bacteria was isolated from the lesion of gill and viscera of the diseased Salvelinus fontinalis．After artificial injection with the bacterial suspensions，the healthy Salvelinus funtinalis showed the symptoms similar to those in natural disease．Another strain of the same pathogen was isolated from diseased fry caused by artificial infection．The results showed that the bacteria were short and rounded at both ends．the bacteria were gram negative，D－glucose－positive，malonic acid－positive，glucose－positive，colistin－negative，esculin－negative，and L-Arabinose－negative．This bacteria with the 16S rRNA gene sequence analysis showed that the bacterium was most closely related to Aeromonas hydrophil，and the strain was identified as Aeromonas hydrophil．The antibiotic sensitivity analysis showed that bacteria strain was resistant to ciprofloxacin，ampicillin，and cefazlin and sensitive to amikacin，and imipenem．In conclusion，we demonstrated that the bacterium was Aeromonas hydrophil，and drug sensitivity identified some kinds of drugs which were highly sensitive to the bacterium．

Salvelinus fontinalis;Aeromonas hydrophil;isolation and identification;drug sensitivity test

LI Yue－hong

S943

A

0529-6005(2017)01-0096-04

2016－05－03

国家自然科学基金(30972191);吉林省农业产业技术体系(201506);吉林省留学回国人员创新创业项目(201523)

巴翠玉(1992－)，女，硕士，主要从事分子病原微生物学与分子免疫学研究，E－mail:bacuiyu@163．com

李月红，E－mail:liyhong@sina．com