安神补心胶囊对小鼠大脑内神经递质影响

陈汉裕 陈凤丽 林赞檬 杨忠奇

(1 广州中医药大学，广州，510405； 2 广州中医药大学第一附属医院，广州，510405)

安神补心胶囊对小鼠大脑内神经递质影响

陈汉裕1陈凤丽1林赞檬1杨忠奇2

(1 广州中医药大学，广州，510405； 2 广州中医药大学第一附属医院，广州，510405)

目的：观察安神补心胶囊对小鼠大脑神经递质5-羟色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响，初步探讨安神补心胶囊改善睡眠作用机制，为临床研究提供实验理论依据。方法：将昆明小鼠随机为空白对照组、地西泮对照组、安神补心胶囊组，分别灌相应药物：0.9%氯化钠注射液、地西泮水溶液(0.1 mg/mL)及安神补心胶囊水溶液(0.1 g药丸/mL)，每天灌胃给药1次(0.1 mL/10 g)，连续灌胃8 d，末次给药后，用酶联免疫吸附测定法测定小鼠大脑5-HT及GABA含量。结果：空白对照组、地西泮对照组、安神补心胶囊组5-HT含量分别为(604.56±31.35)ng/mL、(468.42±30.33)ng/mL、(518.21±31.20)ng/mL；GABA含量分别为(10.77±1.04)μmol/L、(14.58±0.75)μmol/L(12.07±0.88)μmol/L。与空白对照组相比，安神补心胶囊组能明显降低小鼠大脑5-HT含量及提高小鼠大脑GABA含量，差异有统计学意义(P<0.05)，与地西泮对照组比较，差异亦具有统计学意义(P<0.05)。结论：安神补心胶囊具有良好的改善睡眠作用，其作用机制可能与抑制减少大脑5-HT的合成及刺激增加大脑GABA的分泌有关。

安神补心胶囊；神经递质；睡眠；机制

安神补心胶囊主要由五味子(蒸)、丹参、石菖蒲和安神膏(合欢皮、菟丝子、墨旱莲、女贞子、地黄、首乌藤、珍珠母)组成，是由《中华人民共和国药典》中收载的“安神补心丸”改制而成。方中珍珠母咸寒，善于重镇潜阳而安神，《饮片新参》[1]言其能“平肝潜阳，安神魂”，尤长于治疗肝阳上亢之心悸失眠；五味子味酸、甘，性温，主入心肾及肺经，能收敛安神，补肾宁心；地黄味甘质重，能滋阴养血以潜浮阳；合欢皮甘平，擅长解郁安神；女贞子甘凉，补益肝肾，《神农本草经》[2]称其能“安五脏，养精神，除百病”，与合欢皮同用补肾宁心，以助珍珠母、五味子安神之力，与墨旱莲、菟丝子同用，以增滋补肝肾之效。石菖蒲、丹参皆入心经，开心窍，菖蒲能醒神益智，而丹参养心血而宁心，二药配入方中，不仅增强补心安神之效，且使诸药补而不滞，滋而不腻。本方既含酸味，又有辛味，辛甘化阳，酸甘养阴，同时寒温并用，使寒而不遏，温而不燥，诸药配伍，共奏补肾宁心安神之效。临床上主要用于治疗心悸失眠等病症，并取得了一定疗效。而在动物实验方面，有相关研究表明本药具有减少小鼠自主活动次数，延长小鼠睡眠时间，与戊巴比妥钠具有协同作用[3-4]。然而，目前对安神补心胶囊改善睡眠作用机制尚不明确，尤其在神经递质方面的有关报道更为少见[5]。因此，本实验通过观察安神补心胶囊对小鼠大脑神经递质的影响，初步探讨安神补心胶囊改善睡眠作用的分子机制，为临床研究提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验用药 地西泮(山东省平原制药厂，LOT：130301，规格：2.5 mg×100片)。根据动物给药剂量体表面积折算公试，得小鼠给药剂量为1 mg/kg[6]，将地西泮片压碎，过100目筛，用纯净水配成浓度为0.1 mg/mL；安神补心胶囊(聚协昌药业有限公司，国药准字Z10960053)，成人用量为6 g/d，按上述公式计算出小鼠给药剂量约1 g/kg，将丸剂溶解于温水中，配成水溶液0.1 g药丸/mL。最后将上述水溶液置于4 ℃冰箱中备用。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠24只，雌雄兼用，小鼠均来自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0034，体质量20～25 g。

1.3 实验仪器 AE200电子分析天平(上海METTLER公司)；T25高速分散机(IKA LABORTECHNIK；MDF-U3386S医用低温箱：SANYO)；TLXJ-IIC离心机(上海安亭科学仪器厂)；Mk3酶标仪(Thermo Electron Corporation)。

1.4 实验步骤 将SPF级昆明小鼠24只，放入SPF级实验室适应性喂养3 d后，应用随机数字表分为地西泮对照组、安神补心胶囊组、生理盐水对照组，每组8只，雌雄各半，每组灌相应溶液：地西泮水溶液(0.1 mg/mL)、安神补心胶囊水溶液(0.1 g药丸/mL)、0.9%氯化钠注射液，每天灌胃给药1次(0.1 mL/10 g)，连续灌胃8 d，末次给药后，禁食6 h，将3组小鼠脱颈椎处死，立即在枕骨大孔边缘处迅速剪断颈部，去除颅骨，暴露出大脑组织，用小勺子将脑组织完整取出，在冰培养皿上去除小脑，分离出大脑后，在冰冷生理盐水中洗去血液、组织，用电子天平称重，将小鼠大脑放入离心管内，并加入与小鼠大脑重量相等的生理盐水3倍，充分匀浆，离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，用小鼠5-HT及GABA的ELISA试剂盒按说明书处理后，在酶标仪450 nm处进行检测5-HT及GABA含量。

1.5 5-羟色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)标准曲线建立 配置标准品溶液，并用小鼠5-HT ELISA试剂盒进行含量测定，以标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程：y=137.36x-9.953 9(R2=0.999 51，n=6)。见下图标准曲线1，图中表明样品中5-HT含量在不超过240 ng/mL时线性关系良好。以同样的方法计算出GABA的直线回归方程：y=5.515 2x-0.420 64(R2=0.999 53，n=6)。见下图标准曲线2，表明样品中GABA含量小于8 μmol/L时线性关系良好。

1.6 5-羟色胺(5-HT)及γ-氨基丁酸(GABA)标准曲线建立 配置标准品溶液，用酶标仪在450 nm波长下测定对应吸光度(OD值)，根据OD值计算出标准曲线的直线回归方程：y=137.36x-9.953 9(R2=0.999 51，n=6)。见下图标准曲线1，图中表明样品中5-HT含量在不超过240 ng/mL时线性关系良好。以同样的方法计算出GABA的直线回归方程：y=5.515 2x-0.420 64(R2=0.999 53，n=6)。见下图标准曲线2，表明样品中GABA含量小于8 μmol/L时线性关系良好。

图1 5-HT标准曲线1

图2 GABA标准曲线2

2 结果

各组小鼠大脑组织5-HT与GABA测定结果见表1、表2及图1、图2。对各组小鼠所测得的5-HT及GABA含量数据进行组间方差齐性分析，得F值等于39.60和37.47，P均小于0.01，因此可认为方差不齐，宜采用Dunnett′s T3检验。与空白对照组相比，地西泮对照组与安神补心胶囊组均能明显降低小鼠大脑5-HT含量及提高小鼠大脑GABA含量，差异有统计学意义(P<0.05)。安神补心胶囊组与地西泮对照组比较，地西泮对照组更能显著降低小鼠大脑5-HT含量及提高小鼠大脑GABA含量(P<0.05)。结果表明安神补心胶囊能治疗失眠的作用机制可能与减低大脑5-HT及升高大脑GABA的含量有关。

图3 各组小鼠大脑组织5-HT含量测定结果

图4 小鼠大脑组织GABA含量结果测定

组别鼠数(只)5⁃HT浓度(ng/mL)GABA浓度(μmol/L)空白对照组860456±31351077±104地西泮对照组846842±30331458±075安神补心胶囊组851821±31201207±088

表2 3组小鼠大脑5-HT及GABA含量多重比较结果

注：①、②、③分别代表生理盐水对照组；地西泮对照组；安神补心胶囊组。

3 讨论

然而，目前对安神补心胶囊改善睡眠作用机制的研究主要在动物行为学方面，而对其在中枢神经递质影响方面的报道鲜为少见。通过干预检测中枢神经递质的含量，从而探讨其改善睡眠的作用机制已成为中药研究的重要途径。相关研究表明，与睡眠密切相关的神经递质有5-HT、GABA、神经肽S(NPS)、神经肽Y(NPY)、多巴胺(DA)等[13-17]，其中5-HT和GABA是大脑中枢主要调节睡眠的神经递质。本研究结果表明，安神补心胶囊组能明显降低小鼠大脑5-HT含量及提高小鼠大脑GABA含量，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。根据该结果可提示安神补心胶囊能改善睡眠的作用机制可能与抑制减少大脑5-HT的合成及刺激增加大脑GABA的分泌有关。

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(2016-04-03收稿 责任编辑：张文婷)

Effects of Anshen Buxin Capsule on Neurotransmitter in Cerebral Tissue of Mice

Chen Hanyu1, Chen Fengli1, Lin Zanmeng1, Yang Zhongqi2

(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 2TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Objective:To study the effect of Anshen Buxin capsule on serotonin ( 5-HT) and γ-aminobutyric acid content in cerebral tissue of mice, so as to make a preliminary discussion on its mechanism of improving sleep and then experimental theory for clinical study. Methods:Kunming mice were randomly divided into 3 groups, and each group was filled the corresponding drugs intragastrically:normal saline,aqueous solution of diazepam (0.1 mg/mL) and Anshen Buxin capsule (0.1 g/mL). All of those were given once a day (0.1 mL/10 g) and lasted for 8 days. After the last day of drug administration,use ELASA method to detect the content of 5-HT and GABA in mice brain serum.Results:The contents of 5-HT and γ-aminobutyric acid in normal, diazepam and Anshen Buxin capsule group were (604.56±31.35)ng/mL, (10.77±1.04)μmol/L, (468.42±30.33)ng/mL, (14.58±0.75)μmol/L; (518.21±31.20)ng/mL, and (12.07±0.88)μmol/L. Compared with normal saline group, the 5-HT content of Anshen Buxin capsule group reduced and GABA content in cerebral tissue of mice increased with significant differences (P<0.05). Besides, compared with diazepam control group, significant difference also exists (P<0.05). Conclusion:Anshen Buxin capsule had a sound effect in improving sleep quality, and its mechanism may be related to inhibit the production of 5-HT and stimulate GABA secretion in brain.

Anshen Buxin capsule; Neurotransmitter; Sleep; Mechanism

国家级大学生创新创业训练计划项目(编号：201410572008)

陈汉裕(1990.04—)，男，硕士研究生，研究方向：中医药防治心血管疾病，E-mail：659783540@qq.com

杨忠奇(1969.09—)，男，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药防治心血管疾病，E-mail：yang_zhongqi@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.035