恒河猴源犬瘟热病毒N、F基因的克隆与序列分析

邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 静， 郭 平， 郑 颖， 张富强， 范泉水

(中国人民解放军成都军区疾病预防控制中心 ， 云南昆明650118)

恒河猴源犬瘟热病毒N、F基因的克隆与序列分析

邱 薇， 王文博， 胡挺松， 余 静， 郭 平， 郑 颖， 张富强， 范泉水

(中国人民解放军成都军区疾病预防控制中心 ， 云南昆明650118)

为了进一步明确引起恒河猴类麻疹综合征的病原体及其来源，对恒河猴源犬瘟热病毒的N、F全基因进行了克隆和序列分析。得到全长1 572 bp的N基因和2 080 bp的F基因，测序后分别与不同CDV毒株的N、F基因核苷酸和氨基酸序列进行分析，N基因核苷酸(氨基酸)与CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、标准野毒株A75-17同源性分别为93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)；F基因核苷酸(氨基酸)与上述毒株同源性分别为91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)。N、F基因的系统发育分析表明，恒河猴CDV毒株与黑龙江狐狸毒株(CDV-FOX-HLJNM)遗传关系较近，与其他分离株遗传关系相对较远。本研究从分子水平上证明了引起恒河猴发病的病原体为一株CDV野毒株，而非疫苗株。

恒河猴 ； 犬瘟热病毒 ； N基因 ； F基因 ； 序列分析

The clone and sequence analysis of the N and F genes ofcanine

distemper virus in rhesus monkey

犬瘟热病毒(CDV)是当前对我国养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的犬瘟热的病原，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30%～80%，雪貂高达100%，经济损失惨重。随着生态环境的改变、动物和病毒的进化，CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，尤其是灵长类动物的感染[1-2],使其危害也越来越大。本研究对类麻疹综合征死亡的恒河猴脏器中扩增的N和F基因进行了克隆和测序分析，进一步明确了引起恒河猴类麻疹综合征的病原体—犬瘟热病毒为一株CDV野毒株，而非疫苗株。

1 材料与方法

1.1 材料 CDV弱毒疫苗为日本犬瘟热病毒疫苗株，本实验室保存；病料组织取自某动物园死亡的恒河猴肝组织，液氮保存。DH5α由本实验室保存。

病毒RNA/DNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、DNA分子量标准、pMD18-T载体，均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物胶回收试剂盒、质粒(小量)抽提试剂盒，购自上海华舜试剂有限公司；引物合成、纯化及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 引物设计 参照已发表的CHV的N、F基因序列，设计合成两对引物CDV-C-Nf/r和CDV-C-Ff/r，分别扩增全长N基因和F基因(见表1)。用ddH2O按20 pmol/μL稀释，-20 ℃冻存。

表1 CDV N基因和F基因RT-PCR及克隆引物

1.3 N、F基因的克隆 采用病毒RNA/DNA提取试剂盒抽提猴肝组织总RNA，以此RNA为模板，用一步法RT-PCR试剂盒及设计合成的引物分别进行RT-PCR，反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，MgCl210 μL，dNTP Mixture 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase XL 1 μL，AMV-OptimizedTaq1 μL，上、下游引物各1 μL，RNA模板5 μL，dH2O 20 μL，总体积50 μL。RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min后，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。取5 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，将扩增的PCR产物回收后连接到T载体中。1.4 测序及序列分析 阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并拼接，应用DNAMAN软件进行核苷酸和氨基酸序列比对与分析。

2 结果

2.1 CDV N、F基因的扩增 RT-PCR获得大小分别为1 572 bp和2 080 bp的两个片段，与N、F全基因理论值相符(见图1)。

图1 恒河猴CDV-N/F全基因RT-PCR扩增结果

1：F基因阳性对照； 2：CDV-C-Ff/r； 3：CDV-C-Nf/r阳性对照；4：CDV-C-Nf/r； 5：Vero细胞阴性对照； M：DL-2 000分子量标准

2.2 CDV N、F全基因序列同源性分析 猴源CDV N全基因核苷酸(氨基酸)与CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、标准野毒株A75-17同源性分别为93.6%(96.9%)、97.3%(99.0%)和97.3%(99.0%)，与国内外流行的部分毒株同源性介于92.8%～98.7%(96.9%～100%)之间。F全基因核苷酸(氨基酸)与CDV疫苗株Onderstepoort、vaccine x、标准野毒株A75-17同源性分别为91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)和94.4%(97.9%)，与国内外流行的部分毒株同源性介于91.0%～97.4%(96.2%～100%)之间。

2.3 CDV N、F全基因系统发育分析 猴源CDV N/F全基因核苷酸序列与国内外已知代表性毒株序列的系统发育分析结果表明，该CDV毒株与黑龙江(HLJNM)狐狸分离毒株遗传关系较近，与其他分离株及疫苗株遗传关系相对较远(见图2)。

3 讨论

犬瘟热病毒自然感染的动物范围不断扩大，其危害也越来越大。特别是近年来犬瘟热在非人灵长类动物中的暴发,引发了人们对其可能感染人类的潜在危害的思考。首次报道非人灵长类动物感染犬瘟热病毒是Yoshikawa等[3]曾对从野外捕获的22只日本猕猴进行了长达1年半的隔离。试验结果表明，这次日本猕猴发生的是CDV感染，而不是MV及其他麻疹病毒属病毒感染，传染源可能来自兽医院就诊的犬[4-5]。2008年前后，中国和日本的恒河猴先后暴发犬瘟热[1-2,6]，使犬瘟热病毒的跨种传播研究成为了研究的热点[7]。

犬瘟热病毒基因组编码6个蛋白[8]，N蛋白是核衣壳主要成分，保守性较强，野毒株与疫苗株Onderstepoort的N蛋白及其基因的同源性分别为95.2%和93.2%，氨基酸序列差别最大的区域是N端和C端，CDV强毒株N末端可变区氨基酸的改变影响不大，C末端结构的变化能导致M蛋白对核衣壳的吸附作用的改变，强弱毒株C末端的不同能够导致病毒的装配、囊膜的形成和病毒在细胞表面释放的不同[9-10]。F蛋白介导囊膜和细胞膜融合，是感染性病毒粒子进入宿主细胞所必需的，CDV野毒株与疫苗株F蛋白及基因的同源性分别为95.7%和90.1%，F蛋白的13个半胱氨酸残基和4个潜在的N-联糖基化位点完全保守,F蛋白存在高度的表位同源性[11-12]。因此我们选择这两个基因作为研究对象，研究结果进一步说明恒河猴发病的病原体为CDV或其新的变异株，该毒株与黑龙江分离株狐狸毒株(CDV-FOX-HLJNM)遗传关系较近，由此可推测恒河猴饲养场中犬瘟热的传染源可能是由附近的犬或犬科动物传入的野毒株，而非疫苗株。本研究为恒河猴饲养场对暴发类麻疹综合征的恒河猴的治疗提供了一定的参考依据，同时也提示恒河猴的饲养和繁殖单位应加强对犬瘟热的防控，以减少恒河猴的类似感染及死亡所造成的经济损失。

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QIU Wei， WANG Wen-bo， HU Ting-song， YU Jing， GUO Ping， ZHENG Ying，

ZHANG Fu-qiang, FAN Quan-shui

(Center for Disease Control and Prevention of Chengdu Military Region ， Kunming 650118 ， China)

The full-length N and F genes of CDV in rhesus monkey were cloned and sequenced.The full length of N gene and F gene was 1572 bp and 2080 bp,respectively.The results indicated that the homology of the nucleotides(and amino acids) of the N gene with CDV vaccine Onderstepoort vaccine x and standard wild strain A75-17 were 93.6%(96.9%)，97.3%(99.0%) and 97.3%(99.0%)，respectively.The homology of the nucleotides(and amino acids) of the F gene with CDV vaccine Ondersteport and vaccine x and standard wild strain A75-17 were 91.0%(97.8%)、94.9%(98.6%)and 94.4%(97.9%),respectively.The phylogenic analysis showed that the CDV of rhesus monkey had close relationship with Fox strain of Heilongjiang(CDV-FOX-HLJNM).The result proved that the CDV in rhesus monkey was a wild strain,but not a vaccine strain.

Rhesus monkey ； Canine distemper virus ； Nucleocapsid protein gene ； Fusion protein gene ； Sequence analysis

FAN Quan-shui

2016-03-16

公益性行业(农业)科研专项(201303042)

邱薇(1971-)，女，研究员，博士，主要从事动物病毒学、分子生物学研究，E-mail:qiuwei1971@126.com

范泉水，E-mail:fqs168@126.com

S854.4+3

A

0529-6005(2017)02-0026-03