奶牛乳房炎主要致病菌DNA不同提取方法的比较

李 佳 ， 李亚娟 ， 胡俊菁 ， 杜玉兰 ， 何宝祥

(广西大学动物科技学院 ， 广西南宁530005)

奶牛乳房炎主要致病菌DNA不同提取方法的比较

李 佳 ， 李亚娟 ， 胡俊菁 ， 杜玉兰 ， 何宝祥

(广西大学动物科技学院 ， 广西南宁530005)

采用不同DNA 提取方法，比较提取奶牛乳房炎主要致病菌DNA(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，无乳链球菌)的效果。对菌液和牛奶样品，分别用碱性裂解法、煮沸法、试剂盒法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法提取细菌DNA ，并比较DNA浓度、纯度和PCR扩增结果。发现5种方法所得DNA在浓度、纯度和PCR扩增效果上差别较大。结论是提取上述致病菌DNA，求纯选择试剂盒法或水煮法，求速选择苯酚-氯仿法。

奶牛乳房炎 ； 细菌 ； DNA提取

奶牛乳腺炎是一种奶牛常见疾病，给奶牛业造成巨大经济损失。病原菌感染是引起该病的最主要原因。PCR检测操作简便、效率高，其中模板的制备尤为关键。应用不同机理和步骤的提取方法，获得DNA的量及纯度也各不相同。本文对碱性裂解法、煮沸法、试剂盒法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法进行比较，旨在为合理选取奶牛乳房炎主要致病菌DNA 提取方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠杆菌FSCC149005、金黄色葡萄球菌FSCC223005、无乳链球菌CVCC1887均为本实验室保藏。

1.2 主要试剂 溶菌酶、蛋白酶K、细菌基因组DNA提取试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24:1)，购自北京索莱宝科技有限公司；UHT乳，购自超市。

1.3 主要仪器 超微量分光光度计(NanoDrop-2000 C)、PCR扩增仪(德国Biometra公司)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)。

1.4 引物 3种菌引物均参考文献[1]，大肠杆菌rrnb基因(722 bp)，上游引物:5'-ACGGCAAAGT GTGGGTCAAT-3'；下游引物:5'-AGCGTAAGGGTAATGCGAGG-3'。金黄色葡萄nuc基因(464bp)，上游引物:5'-GAAAGGGCAATACGCAAAGAG-3'，下游引物:5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3'。无乳链球菌sip基因(253bp)，上游引物:5'-TATTCTTCTGCGCCAGCTTTG-3'，下游引物:5'-GGGCTGCTAC AGTTCTTACCG-3'。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。

1.5 样品制备 将3种菌增菌，分别取1 mL菌液于EP管，每种菌对应的5法各设3个平行，12 000 r/min 离心2 min，弃上清。收集菌体分别按下述5法处理。分别向菌体中添加纯肉汤和纯奶，作为前3种方法和后2种方法的样品，并设纯肉汤和纯奶为阴性对照。

1.6 DNA提取方法 碱性裂解法、煮沸法、苯酚-氯仿法、溶菌酶法具体步骤见文献[2-5]。试剂盒提取方法见试剂盒说明书。阴性对照均以苯酚-氯仿法处理。

1.7 DNA浓度及纯度测定 超微量分光光度计(NanoDrop-2000C)检测DNA模板浓度和纯度，每个样品检测3次并取平均值。A260/A280值来衡量蛋白质的去除情况[6]。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度 细菌DNA 浓度见表1，试剂盒法提取DNA的浓度均最低；苯酚-氯仿法的均最高。3种菌比较，可知DNA提取浓度与细菌结构密切相关。结果为平均值±相对标准差(%)。

2.2 DNA纯度 细菌DNA 纯度见表2，仅试剂盒法与煮沸法DNA纯度接近1.8；提取牛奶中细菌DNA的2种方法纯度最低，表明模板中蛋白杂质较多。结果为平均值±标准差。

2.3 PCR扩增 由图1可知，同一种菌的5种方法所提DNA扩增条带明暗程度差异较大，与DNA纯度大小趋势相一致，即DNA纯度越高扩增效果越好。

表1 细菌DNA 浓度 (ng/μL)

表2 细菌DNA 纯度

3 讨论

奶牛乳房炎主要致病菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌3种[7]。大肠杆菌为革兰阴性菌，细胞壁薄，易于破壁；金黄色葡萄球菌和无乳链球菌为革兰阳性菌，细胞壁厚而致密，因此破壁是关键。5种提取方法机理和步骤不同，因此DNA浓度和纯度差异较大，如碱性裂解法破壁能力强且操作简便，减少了DNA损失，DNA浓度高但纯度低；而溶解酶法受菌量，酶抑制剂等因素影响较大，DNA纯度低且异丙醇残留，PCR扩增效果差。

样品方面，与菌液肉汤相比，牛奶成分更复杂，存在干扰DNA提取和PCR扩增的物质[8]，因此直接提取牛奶中细菌DNA的量与纯度均低于先增菌再提取DNA的方法，而它的优势在于DNA提取速度快。若通过提取方法改进可实现高敏感性和高速的优势结合，更高效率地提取奶牛乳房炎致病菌DNA，为乳房炎诊断争取宝贵的时间，避免因诊断耗时而造成进一步经济损失。

本试验比较先增菌再提取DNA和直接提取牛奶中细菌DNA两种情况得出的结论为：求纯选择试剂盒法或水煮法，求速选择苯酚-氯仿法。

[1] 陈亚明. 奶牛乳房炎致病菌分离鉴定及快速诊断试剂盒的研发与应用[D].南宁：广西大学,2014.

[2] 钱雪琴,张军,沈芳. Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J]. 中国卫生检验杂志,2008,08:1565-1566.

[3] 冯广达,陈美标,羊宋贞,等. 用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较[J]. 华南农业大学学报,2013,03:439-442.

[4] P. Phuektes P D， Mansell G F. Browning, Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay for Simultaneous Detection of aureus andStreptococcal Causes of Bovine Mastitis [J].Journal of Dairy Science, 2001,184(5):1140-1148.

[5] 洪颖,肖震,祝长青,等. 牛奶中无乳链球菌DNA提取方法的比较[J]. 食品安全质量检测学报,2015,12:4832-4838.

[6] 李进波,盛婧,李想,等. 五种DNA提取方法对鱼加工制品DNA提取效果的比较[J]. 生物技术通报,2014,04:43-49.

[7] Andres C G,Juan Miguel R.Mastitis:comparative etiology and epidemiology[J]. Journal of Mammary Gland Biology & Neoplasia，2011, 16:339-356.

[8] Riffon R, Sayasith K, Khalil H,etal.Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR [J]. Journal of Clinical Microbiology, 2001,39(7):2584-2589.

2016-02-24

南宁市西乡塘区科技局项目(2014308)

李佳(1991-)，女，硕士生，从事奶牛乳房炎检测方法研究，E-mail:lijiamilk@163.com

何宝祥，E-mail:hebaox@gxu.edu.cn

S858.23

A

0529-6005(2017)02-0040-02