PDGFRA在肺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖和侵袭能力的影响

陆 玲， 黄志卫

(1.广西壮族自治区北海市结核病防治院呼吸内科， 广西 北海 536000 2.广西壮族自治区钦州市第一人民医院重症医学科， 广西 钦州 535000)

PDGFRA在肺癌细胞系中的表达及其对细胞增殖和侵袭能力的影响

陆 玲1， 黄志卫2

(1.广西壮族自治区北海市结核病防治院呼吸内科， 广西 北海 536000 2.广西壮族自治区钦州市第一人民医院重症医学科， 广西 钦州 535000)

目的：明确血小板源性生长因子受体A(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：在8种肺癌细胞系以及正常肺细胞HBE中通过RT-PCR方法检测PDGFRA的基本表达水平，分别选取PDGFRA表达高的两组肺癌细胞系(A549)通过慢病毒转染构建稳定knock down和过表达PDGFRA细胞系，再进一步通过MTS，划痕实验，transwell实验以及western-blot实验明确PDGFRA对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。 结果：与对照组相比，过表达PDGFRA后，细胞增殖以及侵袭能力显著增加，同时与侵袭能力相关的细胞黏附分子E-cadherin和细胞骨架蛋白Vimentin表达上调，划痕实验和transwell实验结果表明PDGFRA能够促进细胞侵袭能力。在knock down PDGFRA细胞系中，细胞增值能力降低，细胞黏附分子E-cadherin和细胞骨架蛋白Vimentin表达下调，与对照组相比，细胞侵袭能力下降。结论：PDGFRA能够促进肺癌细胞增殖并有助于肺癌细胞的侵袭转移。

血小板源性生长因子受体α； 细胞增殖； 细胞侵袭； 肺癌细胞

在各类恶性肿瘤中，肺癌是的发病率和死亡率居于第一[1]。肺癌患者的预后较差，其发生机制尚不明确。血小板源性生长因子受体α多肽(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)是一种生长因子受体，是胃肠道间质瘤的重要参考指标[2]。研究表明，PDGFRA可表达于多种肿瘤细胞，且与恶性肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中都可检测到PDGFRA基因发生突变，其中包括肺癌[3,4]。在肿瘤的发生发展过程中，生长因子通过与特异性受体结合，进而影响肿瘤细胞的增殖及侵袭能力。本研究拟探讨PDGFRA对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞:人正常肺支气管上皮细胞HBE，人肺癌细胞系A549、H358、PC9、95C、H1299均购自中国医学科学院研究中心。

1.2 主要试剂:RPMI-1640培养基(Hyclone)、DMEM培养基(Hyclone)、Fetal Bovine Serum (Hyclone)、逆转录试剂盒(Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR试剂盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、细胞增殖能力检测试剂盒(MTS, Promega)、BCA Assay Reagent(美国Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)。

1.3 主要抗体:PDGFRA antibody (santa cruz, sc-338)、E-cadherin antibody(Abcam, ab15148)、Vimentin antibody(Abcam, ab92547)、β-actin antibody(santa cruz, sc-4778)。

1.4 RT-PCR检测PDGFRA基因的表达:TRIZOL法抽提细胞总RNA。紫外分光光度仪检测RNA浓度，取5μg RNA进行逆转录反应，采用Cyber Green荧光实时定量PCR反应体系检测基因表达水平。反应条件：预变性 94℃4 min，扩增条件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，40 个循环。PDGFRA 上游引物: TTGAAGGCAGGCACATTTACA; PDGFRA下游引物：GCGACAAGGTATAATGGCAGAAT；扩增引物大小为119bp。以β-actin为内参基因，其上游引物序列为TGGCACCCAGCACAATGAA；下游引物序列为CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；目的片段大小为186bp。

1.5 Western-Blot检测PDGFRA、E-cadeherin以及Vimentin表达水平 收集肺癌细胞，裂解液裂解，提取蛋白质，BCA 法行蛋白定量分析，湿转至 PVDF 膜，5 % 脱脂奶粉封闭 1.0h，一抗 4℃孵育过夜，二抗 37℃孵育 1.5h，发光液曝光显影。一抗浓度比为1：1000，二抗浓度比为1：3000，以β-actin作为内参。

1.6 慢病毒转染构建稳定knock down PDGFRA细胞系 利用二代慢病毒包装系统在A549细胞中构建稳定knock down PDGFRA 细胞系，用Lipofectamine 2000以2.5:1的体积比将慢病毒shRNA质粒(6μg/dish)、packing质粒(psPAχ2, 4.5μg/ dish)和envelop质粒(pMD2.G; 1.5 μg/ dish)一并转入293T细胞,7h后更换正常培基，培养48h，过滤收集上清液，并将带有慢病毒的上清液感染A549细胞，感染3d后，使用puromycin筛选稳定细胞系，并进行Western-Blot验证。有效shRNA序列为 shPDGFRA#1: GCCTTTGTACCTCTAGGAATG; shPDGFRA#2：GCTTGAAGGCAGGCACATTTA; shCtrl: CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA,具体步骤参见文[5]。

1.7 MTS法检测细胞增殖活力:收集对数生长期细胞，以4×103个细胞每孔的细胞浓度，将细胞接种至96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液(设置5个复孔)，置于5%CO2，37℃培养箱中培养。分别检测细胞24h，48h以及72h的细胞增殖活力，MTS与培基以1:5的比例混合均匀，混匀后于生化培养箱中孵育60min后用多孔板酶标仪在490nm检测吸光度。

1.8 细胞侵袭实验以及细胞划痕修复实验:采用 Transwell 小孔迁移试验检测细胞的侵袭能力，具体步骤见参见文[6]及说明书。

2 结 果

2.1 五株人肺癌细胞系中PDGFRA的基本表达水平:运用 RT-PCR 方法检测发现，肺癌细胞中PDGFRA的 mRNA 水平相较人正常肺支气管上皮细胞(HBE)均显著升高，其中 A549 肺癌细胞的PDGFRA水平最高(图 1)。进一步用 Western-blot方法检测PDGFRA的蛋白水平(图 2)，同样也发现在五株肺癌细胞系中PDGFRA的蛋白水平也均高于正常肺上皮细胞，而且蛋白水平与 mRNA 相一致。

图1 PDGFRA在正常肺上皮细胞及五种肺癌细胞系中的mRNA表达水平

图2 PDGFRA在正常肺上皮细胞及五种肺癌细胞系中的蛋白表达水平

2.2 在A549细胞中构建稳定knock down PDGFRA细胞系，检测其mRNA和蛋白水平以及对细胞增殖活力的影响:针对PDGFRA基因，设计两组shRNA以及对照组随机插入序列，利用二代包装系统包装成慢病毒。挑选PDGFRA表达最高的A549使用慢病毒进行感染，观察干扰效果。慢病毒连续感染二次后，使用puromycin进行筛选，获得稳定knock down PDGFRA细胞系。收集细胞抽提总蛋白以及RNA，利用Western-blot及RT-PCR方法检测PDGFRA的mRNA及蛋白表达水平。进而利用MTS方法检测knock down PDGFRA后，细胞增殖活力的变化。实验结果如图3～5所示，两组shRNA慢病毒干扰序列均有效，其中#1干扰效率为50%，#2干扰效率为70%以上，RT-PCR检测PDGFRA在A549细胞中的表达水平，结果如图3所示，表明干扰效果均有显著抑制，并具有统计学意义。进一步抽提细胞总蛋白，Western-Blot分析慢病毒感染后对蛋白水平PDGFRA的下调水平，发现shPDGFRA#1和shPDGFRA#2慢病毒感染后，PDGFRA蛋白表达水平均显著下调，尤其是shPDGFRA#2的A549细胞中，下调最为明显，结果与mRNA检测一致，如图4所示。MTS法连续检测3d对照组及knock down PDGFRA稳定细胞系中的细胞增殖活力改变，如图5所示，在经过慢病毒感染后的稳定knock down PDGFRA细胞中，细胞在第2天细胞增殖活力下调，在第3天细胞增殖活力显著下调，且都具有统计学差异，这表明PDGFRA基因能够促进肺癌细胞的增殖能力。

图3 慢病毒感染A549细胞对PDGFRA的mRNA表达水平的影响

图4 慢病毒感染A549细胞对PDGFRA的蛋白水平的影响

图5 干扰下调PDGFRA表达对肺癌细胞增殖活力的影响

2.3 干扰PDGFRA表达水平对肺癌细胞侵袭能力的影响:因shPDGFRA#2细胞对PDGFRA的干扰最为明显，故本实验选定shPDGFRA#2稳定敲除PDGFRA的A549细胞进行侵袭实验，采用 Matrigel 侵袭实验检测PDGFRA稳定敲除细胞及对照组细胞中，细胞侵袭能力的变化。如图6所示，对照组A549细胞穿过人工基底膜的细胞数为864.0±46.9个，而在慢病毒感染下调PDGFRA的实验组中，细胞数为156.0±35.8，与对照组相比，稳定敲除PDGFRA的肺癌细胞穿过人工基底膜的细胞数显著下调(P<0.001)，结果提示PDGFRA可能在肺癌的侵袭过程发挥促侵袭作用。

图6 感染下调PDGFRA表达水平对肺癌细胞侵袭能力的影响

2.4 干扰下调PDGFRA表达水平对肺癌细胞转移能力的影响:通过细胞划痕修复实验，观察对照组细胞以及稳定敲除PDGFRA的shPDGFRA#2细胞系中，肺癌细胞迁移能力的改变。在划痕刚开始及24h后这两个时间点进行拍照，比较两组细胞的迁移能力，如图7所示，与对照组相比，下调PDGFRA后细胞迁移能力下调，这表明PDGFRA可能在肺癌细胞的转移过程中发挥促进作用。

图7 干扰下调PDGFRA表达水平对肺癌细胞转移能力的影响

2.6 干扰下调PDGFRA表达水平对肺癌细胞中E-cadeherin和Vimentin蛋白表达水平的影响:有文献报道指出E-cadeherin和Vimentin在上皮间充质转化中发挥重要作用，它们的表达水平可作为肿瘤细胞侵袭转移的标志性特征。而上述研究表明PDGFRA可能在肺癌细胞侵袭转移过程中发挥促进作用。因此，笔者抽提慢病毒感染后构建的A549稳定敲除PDGFRA细胞系的总蛋白，Western-Blot检测E-cadeherin和Vimentin的蛋白表达水平。如图8所示，PDGFRA下调后，E-cadeherin和Vimentin的表达水平都有显著下调，这进一步证实了，PDGFRA在肺癌细胞侵袭转移过程中的重要作用。

图8 干扰下调PDGFRA表达水平对肺癌细胞E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的影响

3 讨 论

血小板源性生长因子受体A((platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)PDGFRA 位于染色体4q12，与配体PDGFS结合后，可促进肿瘤的血管生成。有研究报道，在肺鳞癌中，PDGFRA有8.7%的高表达[7]。在针对PDGFRA表达的各种肿瘤研究中，对比肿瘤细胞和正常上皮细胞，出现了几乎一致的结果，表明PDGFRA与肿瘤的恶性化程度密切相关，并且PDGFRA 的突变异构体近年来在肿瘤的研究中越来越热门，在肺癌及胃肠道肿瘤中，PDGFRA具有较高的突变率。PDGFRA的突变会致使KIT酪氨酸激酶持续活化，细胞增殖分化失控[8]。杨柳青等研究发现胃肠道间质瘤患者的预后复发性转移与PDGFRA的突变呈正相关。顾健人等研究发现在非小细胞肺癌中，PDGFRA的突变为3.1%且与患者的预后不良及非细胞肺癌的侵袭转移有关。这些研究都表明PDGFRA在肿瘤的发生发展过程中作为促癌基因起作用，而在肺癌相关的PDGFRA研究中，发现PDGFRA在肿瘤发生侵袭转移前的持续性活化对于肿瘤的侵袭转移可能具有促进作用，其机制目前尚未明确。

本研究运用 RT-PCR、Westernblot 及慢病毒构建稳定knock down细胞系等方法检测细胞中 PDGFRA的表达， 研 究 结 果 发 现 肺 癌 细 胞 中 PDGFRA的mRNA 和蛋白表达水平高于正常的人肺上皮细胞，进一步通过慢病毒转染构建稳定敲除PDGFRA的A549细胞系，发现PDGFRA下调后，肿瘤细胞增殖活力降低，这表明PDGFRA能够促进肿瘤细胞的增殖。针对 PDGFRA促细胞增殖的能力，结合临床研究中PDGFRA的突变对患者预后及复发性侵袭转移的促进作用，在体外水平监测了下调PDGFRA后，细胞侵袭和转移能力明显下调，结果与郝腾等报道的PDGFRA相关肺癌临床研究相互佐证，确认了PDGFRA对肺癌细胞侵袭能力的促进作用。

目前对于PDGFRA在肿瘤中高表达以及其对肿瘤的侵袭能力作用机制尚未明确，本研究发现，在肺癌细胞系中PDGFRA高水平表达，同时干扰PDGFRA的表达可以有效的降低肿瘤细胞的侵袭转移能力，在分子水平，PDGFRA下调后，能够显著下调E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的表达。E-cadeherin是一种细胞黏附分子，在所有上皮组织中都表达，能够介导上皮细胞的黏附，而细胞间黏附能力的改变是肿瘤发生转移的前提条件，在我们的研究中发现，PDGFRA能够直接影响E-cadeherin的表达，提示在肿瘤发生侵袭转移的过程中，PDGFRA可能通过介导间充质上皮转换的相关分子表达，进而有助于肿瘤细胞的侵袭转移。Vimentin是一种波形蛋白，与肿瘤细胞的运动能力密切相关，同时也是癌细胞发生间充质转换的下游标志信号分子，下调PDGFRA后，Vimentin的表达也同时被抑制。

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Effect of PDGFRA on Cell Proliferation and Invasion in Lung Cancer Cell Lines

LULing,etal

(.DepartmentofRespiratoryMedicineofBeihaiTuberculosisPreventionandTreatmentInstitute,GuangxiBeihai536000,China)

Objective: To evaluate the effect of platelet derived growth factor receptor alpha(PDGFRA) on the proliferation and invasion of lung cancer cells. Methods: The mRNA expression level of PDGFRA in eight lung cancer cell lines and normal lung cell HBE was detected by PT-PCR. Two groups of lung cancer lines(A549) from the high expression level of PDGFRA were selected, then stable knock down and over-expression PDGFRA cell lines were constructed through lentiviral transfection. Furthermore, the effect of PDGFRA on cell proliferation and invasion in these cells were evaluated by MTS, scratch test, Transwell and western-blot test. Results: Over-expression of PDGFRA showed that cell proliferation and invasion significantly increased, meanwhile, E-candherin and Vimentin also increased, scratch test and transwell revealed that PDGFRA significantly improved the cell invasion. Whereas, knock down of PDGFRA decreased the cell proliferation, the expression of E-candherin and Vimentin decreased and the cell invasion also significantly also decreased compared with the control group. Conclusion: PDGFRA can promote the cell proliferation and contribute to the cell invasion in lung cancer cells.

PDGFRA; Cell proliferation; Cell invasion; Lung cancer cells

广西壮族自治区医药卫生计划项目,(编号：Z2014323)

1006-6233(2017)02-0259-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.025