安宫牛黄丸对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织Nrf2蛋白表达的影响

金玉珍，曹平

(重庆市璧山区人民医院急救部ICU，重庆 402760)

安宫牛黄丸对脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织Nrf2蛋白表达的影响

金玉珍，曹平

(重庆市璧山区人民医院急救部ICU，重庆 402760)

目的探讨安宫牛黄丸对脂多糖引起的急性肺损伤的保护机制。方法将40只SD大鼠按随机数字表法分为对照组(Control组，n=10)、脂多糖组(LPS组，n=10)、脂多糖+安宫牛黄丸组(LPS+AG组，n=10)和安宫牛黄丸组(AG组，n=10)。采用一次性腹腔注射脂多糖30 mg/kg建立大鼠急性肺损伤模型。分别检测各组大鼠肺湿重/干重比、支气管肺泡灌洗液蛋白浓度和白细胞计数、肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量、肺组织内转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)水平。结果LPS+AG组肺组织SOD活性为(325.67±7.85)kU/g，明显高于LPS组的(298.75±6.25)kU/g，差异有统计学意义(P＜0.05)。MDA、INF-α含量分别为(1.89±0.35)μmol/L、(35.21±3.12)ng/g，均低于LPS组的(2.78±0.41)μmol/L、(41.52±4.87)ng/g，差异均有统计学意义(P＜0.05)。LPS+AG组肺组织Nrf2蛋白表达为(0.87±0.19)，明显高于LPS组的(0.34±0.11)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论安宫牛黄丸对脂多糖诱发的急性肺损伤具有保护作用，可能与其能激活肺组织Nrf2表达有关。

安宫牛黄丸；脂多糖；急性肺损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛；肿瘤坏死因子α；转录因子NF-E2相关因子2

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是多种原因导致的常见临床综合征，可以视为轻度的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，部分患者将会进一步发展为严重的ARDS，增加临床救治难度，故ALI一直是基础及临床研究中的重点及难点[1]。脓毒症诱导的ALI/ARDS临床中十分常见，往往也是多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)发生的启动原因。既往已对ALI做了大量基础及临床研究，同时也采取了一系列的治疗措施，但总体临床救治效果仍不理想，死亡率仍较高，仍需进一步研究完善[2-3]。祖国医学对于危急重症救治积累了丰富经验，也开发出了较多的经过验证有效的中药制剂。安宫牛黄丸是中医危重病症急救要药之一，现代医学研究发现其药理作用极其丰富，对多种疾病均有明确的救治疗效。部分研究表明安宫牛黄丸对脓毒症大鼠有多器官功能保护作用并能降低死亡率，其中肺保护作用是重要的一环，但对于安宫牛黄丸肺保护作用机制尚不完全明确[4]。近年来研究表明部分药物对ALI的保护机制与转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信号通路密切相关[5-7]。本研究通过观察安宫牛黄丸对脂多糖诱发的ALI的保护作用及其与肺组织内Nrf2表达的关系，探索安宫牛黄丸缓解脂多糖性ALI的作用机制，为安宫牛黄丸的临床应用提供相关的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 安宫牛黄丸(生产批号111004，杭州市胡庆余堂有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG、Western blot检测试剂盒购自美国Upstate Biotechnology公司；小鼠抗大鼠β-actin抗体、Nrf2兔多克隆抗体、ABC试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 实验动物分组及模型制作 40只清洁级Spragne-Dawley(SD)大鼠，体质量(220±40)g，由第三军医大学动物实验中心提供。实验前大鼠禁食12 h，称重后编号，按随机数字表分为四组：对照组(Control组)，腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS液)；内毒素组(LPS组)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖；内毒素+安宫牛黄丸组(LPS+AG组)，腹腔注射30 mg/kg脂多糖，同时造模前0.5 h和造模后6 h按2.0 g/kg剂量灌胃安宫牛黄丸；安宫牛黄丸组(AG组)，腹腔注射磷酸盐缓冲液，注射前0.5 h和注射后6 h按2.0 g/kg剂量灌胃安宫牛黄丸。对照组、内毒素组大鼠灌胃等容积蒸馏水。

1.3 肺湿重/干重测定 40只大鼠按上述处理，在脂多糖注射后48 h按颈椎脱臼法处死，剪开胸腔，暴露肺组织，取右肺中下叶称取湿重(wet weight，W)，再置于80℃烤箱中24 h至重量恒定即干重(dry weight，D)。计算肺组织湿重/干重比值。

1.4 支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)蛋白浓度和白细胞(white blood cell，WBC)计数 按规定时间处死大鼠后立即开胸取肺，切开右主支气管，插入长约5 mm细塑料软管，手术线加以固定，消毒血管钳结扎左肺，用无菌生理盐水灌洗右肺3次(每次3 mL)并回收灌洗液，最后回收到约7 mL BALF；用毛细玻璃管取80 μL，注入乙酸溶液中进行白细胞计数。将剩余的BALF以1 500 r/min离心15 min，取上清液置于-80℃冰箱保存，用于测定蛋白浓度。

1.5 肺组织中SOD和MDA测定 取大鼠左肺组织用预冷的生理盐水在玻璃匀浆器内充分匀浆，制备为10%组织匀浆，4℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清液，按照测试盒说明书测定SOD、MDA含量。

1.6 肺组织中TNF-α水平含量测定 取左肺组织用预冷的生理盐水在玻璃匀浆器内充分匀浆，制备为10%组织匀浆，4℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书要求操作，显色后经全自动酶标仪读数测定TNF-α蛋白含量。

1.7 Westen-bolt法检测肺组织Nrf2表达 Western blot检测采用常规法进行操作。取肺组织裂解30 min后，移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液置于-80℃保存；Lowry法测定总蛋白量。每孔加样量为20 μg蛋白，将上样缓冲液加入制备的样本中，混匀，煮5 min，10 000 r/min离心10 min，等量上样于7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)。电泳毕，将蛋白转移到PVDE膜，用新鲜配制的含3%脱酯奶粉的PBS液封闭；滴加Nrf-2一抗(抗体浓度1:1 000)过夜，次日应用辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体浓度1:2 000)孵育，最后用化学发光法，X线片显影。蛋白杂交条带进行相对密度扫描并分析。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，正态分布的计量数据多组间均数比较采用单因素方差分析后两两比较行q检验(Newman-Keuls法)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺湿重/干重测定 与Control组比较，LPS组、LPS+AG组湿重/干重比值明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；LPS+AG组湿重/干重比值较LPS组下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肺组织湿重/干重比值情况(±s)

表1 各组大鼠肺组织湿重/干重比值情况(±s)

注：与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05。

组别 只数 肺组织湿/干质量比较Control组LPS组LPS+AG组AG组F值P值10 10 10 10 4.27±0.25 6.31±0.78a5.03±0.51ab4.02±0.22b43.15 0.000

2.2 BALF蛋白含量和白细胞计数 LPS组48 h后大鼠BLAF蛋白浓度和白细胞计数较Control组明显增加(P＜0.05)；LPS+AG组大鼠BLAF蛋白浓度和白细胞计数较LPS组明显下降(P＜0.05)，AG组大鼠BLAF蛋白浓度和白细胞计数与Control组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 肺泡灌洗液中白细胞计数及蛋白含量变化(±s)

表2 肺泡灌洗液中白细胞计数及蛋白含量变化(±s)

注：与Control组比较，aP＜0.05；与LPS组比较，bP＜0.05。

组别 只数 蛋白含量(mg/L)白细胞计数(×107) Control组LPS组LPS+AG组AG组F值P值10 10 10 10 102.27±20.18 197.18±41.02a152.38±29.43ab106.25±21.45b125.48 0.000 4.12±0.29 7.32±0.48a5.03±0.33ab4.21±0.27b37.87 0.000

2.3 肺组织SOD活性和MDA、TNF-α含量测定 与Control组比较，LPS组48 h后大鼠肺组织SOD活性明显降低(P＜0.05)，MDA、INF-α含量显著升高(P＜0.05)；LPS+AG组SOD活性亦有降低，MDA、INF-α有升高，但较LPS明显改善(P＜0.05)；AG组与Control组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

2.4 肺组织Nrf2表达 Control组肺组织Nrf2蛋白少量表达；LPS组48 h后大鼠肺组织Nrf2表达增强；LPS+AG组Nrf2表达在此基础上进一步增强；AG组Nrf2表达较Control组、LPS组明显增强，见图1。

图1 肺组织Nrf2表达

3 讨论

ALI/ARDS是临床上常见的危重急症，临床上很多疾病都容易诱发内毒素相关性ALI。脂多糖是内毒素的主要成分之一，其进入机体后将通过一系列变化导致ALI的发生发展，其中机体氧化还原失衡为重要原因。研究表明机体接触刺激因子后启动自我保护机制，表现为消除化学物及机体内过多的活性氧，阻止细胞脂质过氧化的发生来减轻损伤程度。近年来研究发现抗氧化防御系统相关酶的激活与Nrf2密切相关[8-9]。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，是细胞抗氧化反应的中枢调节者，在多种炎症性疾病的发生发展过程中起到极其重要的保护作用。Papaiahgari等[10]发现博来霉素(BLM)处理后Nrf2-/-小鼠炎症反应、表皮细胞死亡情况及纤维化指标均重于Nrf2+/+小鼠；BLM可引起Nrf2+/+小鼠体内Nrf2表达及活性升高，抗氧化酶及II相解毒酶基因和蛋白水平上调，肺损伤和纤维化标志物蛋白表达要比Nrf2-/-小鼠更低。Lyu等[11]发现基因敲除Nrf2可以加剧小鼠脓毒症器官损害程度，增加死亡率。另有研究发现Nrf2相关通路在吸烟诱发的肺气肿和哮喘等疾病发生发展过程中占据重要作用[12]。部分药物可通过促进Nrf2表达减轻各种原因导致的ALI，均提示Nrf2在细胞抗氧化反应[13-14]。

安宫牛黄丸是祖国医学发展过程中的瑰宝，是温病“三宝”之一，具有清热解毒、芳香辟秽、开窍通闭之功效，漫长的中医发展过程中已证实对温病有独特的疗效，历来是中医危重症急救要药之一。近年来国内研究者应用现代研究技术对安宫牛黄丸及其类方成药治疗脓毒症进行了一系列的研究。张丹等[4,15]将安宫牛黄丸应用于严重腹腔感染的大鼠，发现应用安宫牛黄丸后，脓毒症大鼠肺组织高迁移族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)基因表达较对照组明显下降，肺组织MPO活性明显降低。同时该组大鼠ALI程度明显减轻，死亡率可有效下降。

根据安宫牛黄丸组方为基础，应用现代制药技术研制而成的醒脑静注射液是目前临床上应用较广泛的中成药针剂。胡丹丹等[16]在基础研究中发现醒脑静注射液可通过调节机体NF-κB信号转导通路，抑制重要的炎症因子TNF-α表达减轻脓毒症导致的大鼠心肌损伤，对心肌有明确的保护作用[16]。国内学者在临床研究中将醒脑净注射液应用于烧伤脓毒症患者中，发现能抑制患者创面和血液中的细菌生长，减少菌血症的发生；能有效拮抗炎性介质及内毒素的释放，提高脓毒症的救治疗效，改善脓毒症患者预后，进一步证实了安宫牛黄丸在脓毒症救治中有确切的疗效[17-18]。

本实验发现内毒素诱发大鼠发生ALI时，大鼠肺组织中SOD活性降低，MDA含量增加，表明ALI时肺组织的氧化还原状态平衡的确受到破坏，这与既往众多研究结果一致。应用安宫牛黄丸干预的大鼠肺组织MDA含量减少、SOD活性增加，提示安宫牛黄丸可部分恢复ALI时肺组织氧化还原平衡，减轻氧化应激损害，从而减轻肺损伤的发生。ALI时因氧自由基大量释放，超出机体抗氧化系统清除能力，导致细胞膜脂肪酸链断裂使膜通透性增加，使气血屏障的完整性被破坏及肺泡壁通透性增加等原因导致肺水明显增加，本研究中表现为LPS组大鼠肺湿重/干重明显大于对照组。而安宫牛黄丸干预后大鼠肺湿重/干重较LPS组明显降低，提示安宫牛黄丸可显著减少大鼠肺水的产生，改善氧合情况，减轻肺损伤的程度。本研究中还发现LPS可增加肺组织Nrf2表达，考虑与LPS能激活机体氧化应激系统有关，也说明Nrf2可能参与了机体保护作用。而LPS+安宫牛黄丸组及单纯安宫牛黄丸组Nrf2表达显著增强，提示其可能通过激活肺组织Nrf2表达来抑制LPS诱发的ALI程度。

本研究结果显示安宫牛黄丸可有效抑制脂多糖诱发的急性肺损伤，这种保护性作用可能与安宫牛黄丸激活肺组织Nrf2表达，部分恢复机体氧化/抗氧化平衡有关。但安宫牛黄丸在脓毒症救治中是否有量效关系，是否存在其他不同及机制，尚需进一步研究明确。

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Effects of Angong Niuhuang Wan on expression of Nrf2 protein in lung tissue of rats with LPS-induced acute lung injury

JIN Yu-zhen,CAO Ping.Department of Critical Care Medical,Bi'shan District People's Hospital of Chongqing,Chongqing 402760,CHINA

ObjectiveTo investigate the protective mechanism of Angong Niuhuang Wan(AG)on lipopolysaccharide-induced(LPS-induced)acute lung injury(ALI)in rats.MethodsFourty rats were randomly divided into four groups:control group(n=10),LPS group(n=10),LPS+AG group(n=10)and AG group(n=10).The ALI rat models were established by intraperitoneal injection of LPS 30 mg/kg.The lung wet/dry weight ratio,total protein concentration and WBC count in brochoalveolar lavage fluid(BALF),lung tissue superoxide dismutase(SOD)activity,malonaldehyde(MDA)and tumor necrosis factor α(TNF-α)content,lung tissue nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)levels were respectively examinated among the four groups.ResultsThe SOD activity in lung tissue of LPS+ AG group was(325.67±7.85)kU/g,which was significantly higher than that of LPS group of(298.75±6.25)kU/g,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The content of MDA and INF-α of LPS+AG group were respectively (1.89±0.35)μmol/L and(35.21±3.12)ng/g,which were significantly lower than(2.78±0.41)μmol/L,(41.52±4.87)ng/g of LPS group,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expression of Nrf2 protein in lung tissue of LPS+AG group was(0.87±0.19),which was significantly higher than that of LPS group(0.34±0.11),and the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionAngong Niuhuang Wan has protective effects on LPS-induced ALI, and it may be related to the activation of Nrf2 expression in lung tissue.

Angong Niuhuang Wan(AG);Lipopolysaccharide(LPS);Acute lung injury(ALI);Superoxide dismutase(SOD);Malondialdehyde(MDA);Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α);Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)

R-332

A

1003—6350（2017）05—0689—04

2016-09-01)

重庆市卫生计生委医学科研项目(编号：2016MSXM180)

曹平。E-mail：zzjeicu@yeah.net

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.001