细胞转运蛋白及其工程化应用

杨坤，王颖，李春

（北京理工大学生命学院生物工程系，北京100081）

细胞转运蛋白及其工程化应用

杨坤，王颖，李春

（北京理工大学生命学院生物工程系，北京100081）

细胞转运蛋白种类繁多，在细胞中进行营养物质的摄取、代谢产物释放以及信号传递等生理活动中发挥着重要作用。根据细胞转运蛋白的转运方式可分为：通道蛋白、载体蛋白和ATP驱动泵，其中，ABC 转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）属于细胞中依赖三磷酸腺苷（ATP）水解供能的跨膜转运蛋白，其参与动物细胞的多药耐药性以及植物体在外界胁迫条件下的自我防御而受到广泛关注。对细胞转运蛋白的清晰认识是进行有效利用的基础，因此本文综述了植物、动物和微生物细胞中有关代谢产物和药物等物质转运相关的ABC转运蛋白的结构、转运机制。总结了当前细胞转运蛋白在各领域的工程化应用进展和需要解决的问题，旨在为更全面高效地利用细胞转运蛋白进行抗癌新药的研究开发、提高农作物的抗逆性和微生物细胞工厂的高效生物制造提供借鉴。

生物膜；转运蛋白；传递；生物制造；合成生物学

细胞转运蛋白广泛分布于细胞膜表面，介导了生物膜上几乎所有的物质交换和信号传导过程[1]。按其转运方式的不同，细胞转运蛋白可分为以下三类：①通道蛋白，是一类由疏水氨基酸组成的横跨细胞膜双分子层的蛋白质，介导着适宜大小的分子和带电离子通过，如水通道蛋白、钙离子通道蛋白等[2]。②载体蛋白，是一类通过自身构型的变化来改变与底物分子间的亲和力，从而促进底物的跨膜运输的蛋白质。运载底物包括糖、氨基酸、核苷酸等水溶性小分子物质。如葡萄糖与红细胞上的血红蛋白相结合，通过构象变化使葡萄糖顺利通过细胞膜进入细胞[3]。③ATP驱动泵，是一类依赖三磷酸腺苷（ATP）水解提供能量促使底物分子逆浓度梯度跨膜转运的蛋白质。根据它的分布和转运特点又分为：P型ATP驱动泵，其广泛分布于细胞质膜上，辅助Na+、K+的转运，维持细胞的稳态[4]。F型ATP驱动泵，在线粒体膜、叶绿体膜及细菌质膜上，由多亚基的F1和F0两大部分组成，利用ATP水解供能，将H+泵出胞外，建立跨膜的电化学质子梯度，辅助细胞摄取所需的营养物[5]。ABC驱动泵，也称ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters），是一类依靠ATP水解提供能量促使底物在细胞内外跨膜转运的蛋白质家族[6]。目前，研究发现的ABC转运蛋白数目已经有100多种，其广泛分布在从细菌到人类的各类生物体细胞中，参与生物体内许多重要的生理功能，如在植物体内参与次生代谢产物的累积和外排，保护植物体免受外界不良环境的胁迫，帮助植物更好地繁殖和进化[7]；在动物细胞中参与营养物质的吸收，部分毒性物质的分泌排放以及调节细胞内pH等来维持细胞的稳态；另外许多致病细菌还能依赖自身转运蛋白外排作用来降低药物在细胞内的有效浓度，导致致病菌出现耐药现象等[8]。

当前已有许多研究致力于将细胞转运蛋白应用到生物制造中，来解决人们所面临的问题，比如在微生物细胞中构建或加强转运蛋白的表达体系，通过外排难以自由通过细胞膜的目标产物，以此来减轻细胞负荷，达到进一步提升工程菌生产目标产物产量的目的。在植物细胞中，利用转运蛋白来使作物对土壤中的矿物质元素高效吸收，从而使农作物从整体上提高对不良环境的耐受性。在动物细胞中，通过对转运蛋白在药物外排转运机制的研究，来生产出高效抗癌药物等。本文综述了细胞转运蛋白的分类以及当前的工程化应用，旨在为人们更高效利用工程微生物合成所需要目标产物提供借鉴。

1 细胞转运蛋白结构及其转运机制

1.1 通道蛋白

通道蛋白是一类由疏水氨基酸组成的蛋白质，横跨细胞膜形成亲水通道，能使一些特定大小的分子和带电离子顺浓度梯度从质膜的一侧转运到另一侧[9]。所有通道蛋白均以自由扩散的方式运输溶质，不消耗能量。大多数通道蛋白在细胞膜间形成有选择性开关的跨膜通道，这些通道又可分为离子通道和水通道。离子通道在神经元与肌细胞神经传递过程中起着重要作用，其包括电压力通道、配体门通道和压力激活通道[10]（如图1）。水通道是指在低渗溶液中水分子不能自由扩散进入细胞，需借助水通道来完成。如肾小球的滤过作用和肾小管的重吸收作用[11]。

1.2 载体蛋白

载体蛋白是生物膜上普遍存在的一类跨膜蛋白质，通过构象的变化促成底物运输。它既可以参与被动运输，又可以参与逆浓度或者电化学梯度的主动运输[12]。图2所示为载体蛋白介导溶质跨膜转运的示意图[13]。通常，载体蛋白与运载分子具有特异性，一个特定的载体只运输一种类型的分子或离子，其转运底物包括糖、氨基酸、核苷酸等水溶性分子等。

图1 三种类型的门控离子通道示意图[10]

图2 载体蛋白通过构象变化介溶质的跨膜运输[13]

1.3 ATP驱动泵

ATP驱动泵（ATP –powered pumps）是一类依靠ATP水解释放能量来进行物质跨膜运输的蛋白质家族。其广泛分布于各种生物膜上，包括P型ATP驱动泵，F型ATP驱动泵，以及ABC转运蛋白[14]。P型位于质膜之中，由α和β2个亚基组成的一种阳离子泵。α亚基起催化作用，β亚基调控驱动泵的活性，共同维持着细胞膜内外离子的稳态。F型多数存在于线粒体内膜，叶绿体囊膜以及细菌质膜上。它在能量转换中起重要作用，F型质子泵不仅可以利用质子动力势将ADP转化成ATP，也可以利用水解ATP释放的能量转移质子，是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子[15]。ABC转运蛋白通常由2个高度疏水的跨膜结构域（transmembrane domain TMD）和2个核苷酸结合域（nucleotide binding domain NBD）组成，ABC蛋白X-射线晶体结构分析表明，TMD拥有底物结合位点，NBD通过水解ATP获得能量，TMD通过疏水作用和NBD结合在一起，共同作用完成底物的跨膜转运过程[16]。

在ABC转运蛋白中，不同的成员间核苷酸结合域NBD序列相对保守，同源性通常是30%～ 40%，通常包含3个特征性基序：ATP结合位点、Walker A 盒和Walker B盒。以及在两盒之间的大约有120个氨基酸的ABC标记（ABC signature），是ABC转运蛋白的特征性序列[17]。跨膜结构域TMD一般由4～6个α螺旋构成，参与底物的识别过程，形成跨膜运输通道来实现底物的跨膜运输。大多数已鉴定的真核ABC转运蛋白中，这4个结构域以正向的TMD1-NBF1-TMD2-NBF2或者反向的NBF1-TMD1-NBF2-TMD2的组织方式连接在一条多肽分子上，形成全分子ABC转运蛋白[18]。图3是植物多向耐药性PDR（pleiotropic drug resistance）蛋白的二级结构示意图[19]，具有典型的ABC转运蛋白结构。

图3 植物PDR转运蛋白结构[19]

2 细胞转运蛋白的生物学功能

2.1 通道蛋白的功能

水通道蛋白AQPs（aquaporins）是细胞膜上跨膜运输水分子的一类特殊通道蛋白质家族[20]，因其参与肿瘤细胞的生长、浸润和转移过程而受到研究人员广泛关注。研究发现，AQP1形成的水通道可以改变癌变组织内的渗透压，进而改变细胞的形体，同时借助于该通道加快肿瘤细胞向周围基质浸润的速度。研究者以此为切入点，有望通过抑制AQPs的表达来为癌细胞的治疗提供新的靶点。如在中枢神经系统中，视神经脊髓炎NMO（neuromyelitis optica）是引起脱髓鞘疾病的直接因素。靶抗体水通道蛋白AQP4因为具有高灵敏性的特点，长期作为NMO和其他中枢神经系统免疫缺陷疾病的有效鉴别方法[21]。

2.2 载体蛋白的功能

载体蛋白是细胞膜中不可或缺的一类膜蛋白，也是许多营养物质如糖、氨基酸等小分子物质进出细胞的通道。如大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌均能通过细胞质膜上的转运载体对环境中所需要的营养物质进行吸收利用，也能将氨基酸分泌到胞外行使相应功能。细胞对葡萄糖的吸收利用也是由葡萄糖载体蛋白来协助完成。从红细胞里分离出来的葡萄糖转运蛋白GLUT1广泛存在于生物体的大脑、神经系统、肌肉等组织器官中，对于维持人的正常生理功能极为重要。已有研究把抑制葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达为突破口，使癌细胞得不到足量葡萄糖供应，达到“饿死”癌细胞的目的[22]。

在生产氨基酸的工程菌中，氨基酸在细胞内的过度积累会引起代谢途径中关键酶的反馈抑制，导致菌体生长过慢，对进一步提高工程菌生产目的产物产量带来不利影响。近年来，氨基酸跨膜转运作为降低胞内产物浓度，解除细胞反馈抑制的有效方法受到人们广泛关注。如GUNJI等[23]将赖氨酸/L-精氨酸转运蛋白（LysE）引入到谷氨酸棒杆菌，并通过发酵优化使赖氨酸达11.3g/L，产量比原始菌高出10倍以上。在L-苏氨酸发酵过程中，细胞内L-苏氨酸的浓度积累到一定程度时，便会对合成途径中的关键酶（如高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合成酶等）产生反馈抑制。梁媛等[24]在L-苏氨酸生产菌Escherichia coliTRFC中成功构建L-苏氨酸转运系统，通过减少胞内L-苏氨酸浓度，从而使L-苏氨酸的产量及糖转化率较原始菌分别提高15.3%和16.1%。通过对微生物细胞中转运蛋白的挖掘和功能探索，可以为氨基酸生产菌株的设计与改造提出有价值的参考依据。

2.3 ABC转运蛋白的功能

2.3.1 植物天然产物的转运与自我防御

植物天然产物是指从植物体内分离出来的次生代谢产物，大多数在抗氧化、抗炎症和抗病毒感染等方面均有明显作用。按其生物合成的起始分子不同，植物产生的次生代谢产物主要可分为萜类、黄酮类、苯丙素类和生物碱等化合物。这些化合物虽然不直接参与植物必需的生命活动，但在植物体内的累积和外排被高度调节，保护植物体免受环境中生物和非生物胁迫的损伤。帮助植物更好地繁殖和进化。已有研究表明，植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的降解、植物抗病和气孔的调节等都与植物ABC转运蛋白有着不可分割的关系[25]。

自1992年国际上报道了第一个从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的ABC转运蛋白AtPGP1以来[26]，已有很多文献陆续报道了植物转运蛋白参与次级代谢产物的积累与排放，对植物生理代谢起着重要调控作用。如KANEDA等[27]发现拟南芥中ABCB亚族基因和AtABC1协调表达，共同参与拟南芥茎的木质化过程，在植物茎中发挥着运输生长素的重要作用。水生植物浮萍SpTUR2（Spirodella polyrhiza）是第一个被鉴定的植物PDR基因[28]，当浮萍在高盐、寒冷的环境便通过大量诱导SpTUR2基因表达来应对非生物环境胁迫压力。MAVEL等[29]研究发现，在木本植物拟南芥叶片中存在着一些挥发性单萜和倍半萜表达基因，当植物体遇到虫害时则会引起植物体内产生大量的挥发性萜类物质，可引起植物开启防御害虫系统。KLEIN 等[30]发现长春花（Catharanthux roseus）中转运蛋白CrMDR1起转运各种单萜和生物碱的作用。黄连素（Coptis japonica）是一种重要的异喹啉生物碱，其大量积累在黄连根茎组织的液泡之中，SHITAN等[31]发现了CjMDR蛋白能识别黄连素并将其作为底物最终转移至液泡中储存。烟草属植物产生的生物碱尼古丁，首先是在根部组织中合成，当受到致病菌和食草动物侵害时，烟草中一种转运蛋白PDR12的表达会显著增加，并将生物碱由植物根部向叶片中的液泡中转移并积累，以此来防御各种侵害。

2.3.2 药物转运与细胞耐药性

在不良环境下，酵母菌通过自身转运体系能很快地克服不良影响。如定位于细胞质膜上的ABC转运蛋白Yorl能将寡霉素外排出细胞[32]。PDR5和PDR12等直接与细胞内多种药物的耐药性有关，能将一些甾醇类、诱变剂和阳离子药物外排出细胞。Aus1p和Pdr11p可以把外源甾体转运到细胞膜内获取营养，酵母细胞膜上的活性因子Pdr3p和Pdr1p促进细胞膜上某些脂类成分的合成和转运，共同来维持细胞的稳态[33]等。

在已报道的人类基因组中，有49个ABC转运蛋白基因，依据序列同源性可分为A～G 7个家族。他们负责不同底物如离子、糖、多肽、蛋白质和大量的疏水化合物和代谢产物的跨膜转运，其中A、B、C、G 4个家族的转运体已被证实与细胞的耐药性密切相关[34]。1976年在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现P-糖蛋白（P-glycoprotein），是一种分子量约17万的ATP依赖性外向膜转运蛋白，由1280个氨基酸残基组成，广泛存在于机体各组织和器官中，参与着多种药物的吸收、分布和排泄过程[35]。从结构上来看，每个P-gp分子由12个跨膜区组成，分成两个对称的部分。每一部分有1个疏水区和1个亲水区，亲水区含1个亲水性核酸结合区（nucleotide-bind domain，NBD），该结构上有1个ATP结合位点。疏水区由6个跨膜区（membrane spanning domains，MSDs）构成，它提供与底物结合位点[36]，而能把许多不同结构的化合物如脂类、氨基酸和一些药物逆向转运出细胞，即“药物外排泵”。

ABC转运蛋白如P-糖蛋白对细胞中多种药物的外排作用一直是肿瘤化疗的重要障碍。一些常规的抗肿瘤药物如：①免疫抑制药物，如环孢素A，莲心碱等；②抗生素类抗肿瘤药，如柔红霉素；③植物碱类，如长春新碱、紫杉醇等；④蒽环类化疗药，如柔红霉素、阿霉素等都是典型的P-糖蛋白底物[37]，能抑制其对细胞内药物泵出到胞外。在P-糖蛋白外排作用的生物学实验中，给实验动物喂食P-gp抑制剂，发现可以提高细胞对于隐丹参酮的生物利用度[38]，而使用P-gp的诱导剂连翘则可降低细胞中其他药物如地高辛、苯二氮草类、茶碱等的血药浓度，从而使细胞内药物浓度无法达到治疗疾病的功效[39]。当前，细胞中仍有相当一部分未知功能的转运蛋白需要研究人员去挖掘和探索。相信通过对转运蛋白的结构和转运机制的深入研究，会为许多疾病的治疗以及抗肿瘤新药的开发提供新思路。

3 细胞转运蛋白的工程化应用

3.1 转运蛋白在癌症治疗中应用

目前，已有许多研究者提出了利用细胞转运机制来进行癌症治疗的新策略。比如来自麻省理工大学的SABATINI等[40]报道了利用癌细胞能够吸收正常细胞无法摄取的毒性物质这一特性，提出过表达癌细胞表面的特定转运蛋白来吸收毒性物质，能有效杀灭癌细胞。单羧酸盐转运蛋白MCT1，是一种临床上的癌症治疗药物，主要通过抑制糖酵解来发挥作用，而许多癌细胞对于糖酵解的上调作用具有较强的依赖性。通过癌细胞表面特定转运蛋白的过表达将MCT1药物转运到癌细胞中对治疗癌症具有靶向性和选择性。

癌细胞扩散也一直是癌症治疗中的难题之一，多数的癌症死亡病例都是由癌细胞扩散造成的。癌细胞可从原发部位转移到肺叶、骨骼或者肝脏等部位，形成新的肿瘤[41]。近期，REYMOND等[42]研究发现一种癌细胞转移所需的关键转运蛋白Cdc42蛋白，以这种蛋白为靶点，或将成为预防癌细胞转移的有效方法。SHORT对小鼠癌细胞以及人类乳腺癌细胞的观察，发现这种蛋白能够帮助癌细胞依附于血管壁上，从而使它们通过血液扩散到身体的其他部位[43]。因此，抑制这种蛋白的表达或者直接往血液中注射抑制剂，阻止癌细胞依附于血管壁内皮细胞，从而防止癌细胞扩散是当前研究治疗癌症的新方向。从理论上来说，这种方法在未来是极有可能实现的。

另一方面，肿瘤细胞因其自身固有的耐药性，而使得对化疗药物不敏感，导致细胞多药耐药（multidrug resistance MDR）现象发生[44]。人们通过对天然产物抑制肿瘤耐药性方面的活性进行了研究，发现了许多天然产物可通过抑制转运蛋白的表达或者竞争性地结合于转运蛋白，从而减少细胞对抗癌药物的外排。如皂甙类混合物可以作用于HepG2/Dox癌细胞，能阻止细胞中P-糖蛋白的过表达，从而降低癌细胞的耐药性，增强癌细胞对药物的敏感性[45]。通关藤提取物对白血病、HL60细胞有明显的抑制和诱导凋亡作用，能有效降低癌细胞表面转运蛋白的功能，进而抑制抗肿瘤药物的外排等[46]。目前，通过药物外排转运机制来筛选天然产物中转运蛋白的抑制剂，是当前开发抗癌药物的热点之一。

3.2 转运蛋白提高农作物产量

一直以来，传统农业技术仅仅通过增加化肥的使用和水供应系统无法同时有效地完成提高农业产量和实现环境可持续发展这两大重要任务。当前已有研究者发现许多植物转运蛋白不仅会穿过农作物的生物膜来对抗有毒的金属离子和昆虫，而且能提高农作物的抗盐性和耐旱性、控制水分流失并存储糖分[47]。这类发现将对全球农业产生深远影响，有助于满足不断增加的全球人口对食物和能源的需求。

比如盐分胁迫会导致种植在灌溉土地上的农作物大幅减产，DUAN等[48]在一项研究中发现，钠转运蛋白在保护植物免受盐胁迫中起着重要的调控作用，将这种钠转运蛋白用于育种研究中，在盐分胁迫环境下，耐盐小麦能将产量提高25%。铝是土壤中第三大元素，当土壤呈酸性时，土壤中的铝离子会释放出来，导致植物中毒。通过人为提高植物根部的铝离子转运蛋白的表达水平则会使植物耐受铝离子的毒性，这使得原先无法利用的贫瘠酸性土壤“变身”为肥沃的农田成为可能。研究者通过有效利用转运蛋白，使得农作物从整体上提高了对外界不良环境的耐受性[49]。

3.3 转运蛋白提高细胞工厂合成天然产物和药物的效率

长期以来，天然产物因其具有广泛的药理学和生物学活性，如抗氧化、提高机体免疫力、抑制癌症等被大量应用于药物的研究开发与设计[50]。但目前大部分天然产物的获取均受到了资源、成本和生产技术的限制，如传统工艺生产抗疟疾药物青蒿素的方法主要是从黄花蒿中提取，但其含量仅占黄花蒿干重的0.881%[51]，过度种植面临着占用耕地、植株采集破坏环境、提取过程繁琐等一系列问题。而伴随着全基因组测序技术、代谢工程和合成生物学的迅猛发展，通过微生物进行跨种属多基因的协同表达与调控，来进行外源产物的“从头合成”可以有效解决来源匮乏和环境破坏等问题。目前已取得可观的技术成果，如KEASLING教授课题组[52]对酵母合成体系进行了一系列优化，包括更换表达菌株、强化HMGR基因表达、敲除半乳糖代谢基因等遗传修饰，同时对发酵过程进行整体优化，最终使得青蒿酸产量提高到25g/L，取得了突破性的成果。STEPHANOPOULOS等[53]将紫杉二烯的合成途径引入大肠杆菌中，并对整个代谢途径进行调控和优化，获得了高产紫杉二烯的大肠杆菌，并将产量提升到1g/L。ZHANG等[54]在酿酒酵母中对β-香树脂醇合成路径进行了构建和调控，构建出了稳定生产β-香树脂醇的酵母工程菌，通过发酵优化后使产量达到138.8mg/L。

但进一步提高目的产量却出现了瓶颈，原因是工程菌生产的目的产物大多是极性化合物，难以自行转运到胞外，在胞内过量积累也给细胞造成了代谢负荷，大大限制了在底盘宿主中的生产效率和工业化应用。因此寻找一种能高效促使目标产物跨膜转运的转运蛋白是减轻工程菌负荷的直接方法。而在植物细胞内，存在着许多转运蛋白参与天然产物的跨膜运输，因此，通过在微生物细胞中构建天然产物胞外转运体系来缓解产物积累所造成的负面影响，是实现产量提高的有效途径，图4是将植物中转运蛋白构建在工程菌中，来促进目标产物胞外转运的示意图。胞外转运还有利于产物的后期提取和处理，这一方法也为其他萜烯类物质的胞外转运和提取提供理论基础和技术支持，对于促进工程菌合成天然产物的工业化生产具有重大意义。

图4 工程菌酿酒酵母中构建植物转运蛋白

4 结语与展望

近年来，随着人们对转运蛋白的结构和功能特性的认知不断加深，并将其应用到生物制造中，大大提升了应用价值。但目前细胞转运蛋白的研究和工程化应用仍处于初级化阶段，要实现高效利用仍然有一些重要的基础理论和技术问题需要解决，如生物体细胞中仍有相当数量的转运蛋白尚未被挖掘；对已报道的转运蛋白，缺乏对空间结构及其参与复杂化合物转运过程的完整理解等，而弄清转运蛋白作用机制是提升其转运效率，实现高效工程化应用的基础。因此，今后研究者的工作应主要集中于以下两个方面：第一，通过对多物种的基因组和转录组数据库进行研究，挖掘出更多潜在功能的转运蛋白；第二，对挖掘出的转运蛋白进行底物结合位点的改造，提升转运蛋白运输效率，充分发挥其应用价值。随着人们对其研究应用的加深，相信转运蛋白将会为生物制造在医疗、生产以及工业化应用等方面带来更广阔的发展空间。

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Cell transporter protein and engineered applications

YANG Kun，WANG Ying，LI Chun
（School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

There are a lot of cell transport proteins. They play an important role in many physiological activities，such as uptaking nutrients，releasing metabolites，and transducting signal processes on biofilms. According to the transporting way of the cell transport proteins，they can be devided into channel protein，carrier protein，and ATP-powered pump. ABC transporters（ATP-binding cassette transporters），which is a kind of cell transporter proteins widely distributed in organisms，can transport a variety of compounds with energy supplied by ATP hydrolysis. In recent years，it has drawn widely attention regarding the multi-drugs resistance of animal cells and the self-defense of plants under external stress. The understanding of the cellular transport proteins provides the basis for effectively using it. This paper illustrated the structures and mechanisms of ABC transporter proteins found in plants，animals，and microbial cells；and summarized the progress of engineering applications of cell transporter proteins in various fields and the remaining problems. Finally，guidance will be provides to use cell transporter proteins in developing cancer drug，improving crop yield as well as efficient synthesis of metabolites in engineered microorganisms.

biofilm；transport protein；ransferring；bio-manufacture；synthetic biology

Q815

A

1000–6613（2017）04–1410–08

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.04.034

2016-09-07；修改稿日期：2016-12-15。

国家杰出青年科学基金（21425624）和中国博士后科学基金面上项目（2015M580052）。

杨坤（1992—），男，硕士研究生。联系人：李春，教授，博士生导师。主要从事生物转化与酶工程、代谢工程与合成生物学、空间微生物技术的研究。E-mail：lichun@bit.edu.cn。