MCP-1在乳腺恶性肿瘤细胞增殖与转移中的作用

吕明丽，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院超声科，上海 200030)

MCP-1在乳腺恶性肿瘤细胞增殖与转移中的作用

吕明丽，周赟，周雷平，牛建梅

(上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院超声科，上海 200030)

目的 探讨人单核细胞趋化因子-1(MCP-1)在乳腺恶性肿瘤细胞增殖转移中的作用。方法构建MCP-1过表达的稳转人乳腺癌细胞MCF-7细胞和空载MCF-7细胞，分别标记为MCP-1过表达MCF-7细胞(MCP-MCF-7)、空载MCF-7细胞(EV-MCF-7)。通过CCK8细胞增殖实验、单克隆形成实验、划痕实验和细胞凋亡检测，观察MCP-1过表达对细胞增殖转移及凋亡的影响。通过real-time PCR法检测MCP-1可能的下游基因。结果成功构建了MCP-1过表达MCF-7乳腺癌细胞株及对照细胞株。CCK8实验显示培养第5天起MCP-MCF-7细胞株在450 nm处的吸光度明显高于EV-MCF-7组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。细胞集落形成实验提示MCP-MCF-7细胞株所形成的集落数量明显多于EV-MCF-7细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)，且前者单个集落的体积亦大于后者。划痕实验中12 h后MCP-MCF-7细胞的迁移能力开始增强，到48 h时划痕更加愈合明显。虽然转染MCP-1后细胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空载细胞(1.10%)，但差异无统计学意义(P＞0.05)，即MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞凋亡无影响。在对MCP-1下游可能基因的分析结果提示MCP-1可以上调p65、MMP2、STAT2基因表达，下调RASSF1基因表达。结论MCP-1具有直接促进乳腺恶性肿瘤细胞的增殖和转移能力，且此种作用可能与p65、MMP2、STAT2、RASSF1有关。

人单核细胞趋化蛋白-1；乳腺肿瘤细胞；增殖；转移

单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1)属于C-C亚族(β亚族)成员，也称为单核细胞趋化和激活因子，因此也缩写为 CCL2。它主要作用是趋化血液中的巨噬细胞进入局部组织中，并与肿瘤细胞相互作用形成一个独特的富含各种生长因子和趋化因子的微环境。越来越多研究发现，肿瘤局部组织中MCP-1表达水平的高低与肿瘤的恶性程度呈正相关，可作为患者预后评价指标之一[1-4]。肿瘤局部微环境中的MCP-1与肿瘤局部血管生成密切相关[5]。此外研究还发现在肿瘤微环境细胞间隙的液体，胸腹水及血清中均检测到MCP-1的存在[6-11]。

由此可见MCP-1在乳腺癌增殖浸润及转移中有着至关重要的作用，那么MCP-1作用机制有哪些呢？目前研究证明CCL2主要通过介导肿瘤细胞同宿主细胞间对话，如趋化巨噬细胞进入肿瘤局部，造成肿瘤局部微环境中单个核细胞免疫失衡，直接或间接释放促血管生成因子，趋化和激活破骨细胞来促进肿瘤的增殖和转移。这些观点得到了大多数学者的认可，但是关于CCL2是否本身即具有直接促进肿瘤细胞恶性特征的研究结果却存在很大争议。目前有学者认为MCP-1不具有直接促进恶性肿瘤生长和存活的作用[12-13]，但可增加肿瘤细胞运动性和迁移能力[14]。

因此本研究将采用慢病毒载体将MCP-1基因导入MCP-1低表达且低度恶性的MCF-7乳腺癌细胞，从细胞功能学实验观察MCP-1对乳腺恶性肿瘤细胞是否具有直接促进作用，并对MCP-1可能的下游基因做初步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞系MCF-7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，慢病毒质粒pCDH及相应的辅助质粒由上海复旦大学医学院分子重点实验室馈赠。人胚肾T细胞(HEK-293T)由本实验室冻存。

1.2 方法

1.2.1 含MCP-1慢病毒质粒的构建与鉴定 于正常人基因组中克隆MCP-1基因片段，将其与慢病毒载体pCDH连接转化。将构建好的慢病毒载体在PUBMED网站经BLAST比对，选用显示完全正确、无突变碱基的构建治疗进行后续实验。将含有MCP-1片段的慢病毒质粒pCDH、包装质粒和衣壳质粒共同转染HEK-293T细胞，并收集病毒血清，之后感染MCF-7细胞。一般未经浓缩的病毒颗粒感染Hela细胞两次后病毒的感染效率可达60%左右。在无菌条件下经流式细胞仪筛选后可获得95%阳性细胞。可通过观察细胞自带的绿色荧光(pCDH中含有GFP绿色荧光蛋白)来评估感染效率和阳性细胞百分比。

1.2.2 细胞培养和增殖实验 细胞培养液为含10%FBS的高糖DMEM培养液。将原始乳腺癌细胞(MCF-7)、EV-含空载质粒乳腺癌细胞(MCF)、含有MCP-1过表达质粒的乳腺癌细胞(MCP-MCF-7)置入37℃、含体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化上述三种细胞，细胞悬液为含10%FBS的高糖DMEM培养液。将细胞接种于96孔板中，每孔体积为100 μL，含细胞数位每孔1×103个，之后置入CO2恒温培养箱中培养。于接种后第0天、1天、3天、5天、7天于每孔中加入20 μL CCK8，37℃恒温培养箱中孵育2 h，置于波长为490 nm处读取光密度(D)值，并轴绘制细胞生长曲线。

1.2.3 单克隆形成实验 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MCF-7细胞后将细胞接种在12孔板中，每孔含1 500个细胞，各3个复孔，之后放入恒温培养箱中培养。第7天时取出细胞，吸弃培养液，并用1×PBS洗涤3次。以0.1%的结晶紫和10%甲醇于室温染色20 min，流水缓慢洗去染色液，空气中干燥后拍照。之后，33%醋酸500 μL/孔洗脱结晶紫，酶标仪洗脱液于检测波长为560 nm处的D值，来评估细胞克隆数。

1.2.4 细胞凋亡检测 0.25%胰蛋白酶消化MCF-7、EV-MCF、MCP-MC-7细胞，细胞接种于6孔板中，每孔细胞数位2×105个，CO2恒温培养箱中培养。2 d后，采用细胞凋亡检测试剂盒AnnexinⅤ-磷脂酰丝氨酸(PE)/7-AAD(7-amino-actinomycin D)试剂盒检测细胞凋亡。收集细胞培养液至离心管中，以胰酶消化细胞之后加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并将其轻轻吹散后再次收集至离心管内。1 000×g离心3～5 min，吸除上清液，加入1 mL 4℃预冷的PBS，重悬后再次离心沉淀细胞，吸除上清液。去离子水按1︰4的比例稀释链接缓冲液，以250 μL链接缓冲液重新悬浮细胞，调节浓度为1×106/mL。取100 μL细胞悬液置于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinⅤ-PE和10 μL 7-AAD溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，加入PBS 400 μL，应用流式细胞仪计数细胞凋亡数量。

1.2.5 细胞划痕实验 胰蛋白酶消化MDA-MB -231-NC、MDA-MB-231-2396细胞，以每孔2×105个细胞接种于12孔板中，CO2恒温培养箱中培养1 d形成单层细胞。在单层培养细胞上，用移液器枪头沿着培养板底部做“一”字形划痕，光学显微镜下记录划痕区的相对位置，再以无血清培养液培养，分别于培养0 h、16 h、24 h、40 h时观察并拍照，计算划痕修复百分比，划痕修复百分比=(细胞迁移距离/划痕距离)×100%。

1.2.6 real-timePCR分析MCP-1下游基因mRNA水平的改变 转录好的MCP-MCF-7和EV-MCF-7细胞的cDNA作为模板，进行 Real-time PCR，检测MCP-1、p65、p52、FOXO3、FOXO1、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1、MMP2的表达情况。上述基因荧光定量PCR引物见表1，每个样本做4个副孔，实验重复3次。GAPDH为内参。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件，组间比较采用独立样本t检验，计量资料以均数±标准差(±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 稳转细胞MCP-1表达情况鉴定 在紫外蓝色荧光视野下观察MCP-1或EV稳转细胞株，可看到两种构建细胞中有绿色荧光表达正常，说明细胞构建成功(图1A、1B)。通过RT-PCR及west-blot半定量检测MCP-1过表达情况。RT-PCR及west-blot结果均显示MCP-1在MCP-MCF-7细胞中的表达明显高于EV-MCF-7细胞和未作任何处理的MCF-7细胞(图1C、1D)。

表1 Real-time RCR引物序列、Tm值及扩增长度

2.2 MCP-1过表达乳腺癌细胞增殖能力明显增强 实验证实从第5天起MCP-1过表达的MCF-7细胞株在450 nm处的吸光度(0.62±0.02)明显高于EV-MCF-7(0.57±0.02)组，且差异有统计学意义(P= 0.049)；第7天时MCP-MCF-7细胞株在450 nm处的吸光度(0.71±0.02)明显高于EV-MCF-7(0.62±0.01)组，且差异有统计学意义(P=0.03)，说明MCP-1过表达乳腺癌细胞增殖能力明显增强(图2A)。同时细胞计数法所得到的实验结果与CCK-8法一致，差异有统计学意义[第5天(286.67±6.51)vs(449.67±18.61)，P=0.00；第7天(797.33±11.15)vs(911.00±10.02)，P=0.00)](图2B)。

2.3 MCP-1可增强MCF-7细胞集落形成能力 细胞接种后第14天时观察细胞单克隆集落形成情况。用显微镜对集落进行计数，结果显示MCP-MCF-7细胞所形成的集落数量(24.17±1.41)明显多余EV-MCF-7细胞(8.96±0.24)，差异有统计学意义(P=0.00)，且前者单个集落的体积亦大于后者。该结果表明MCP-1可增强MCF-7细胞的集落形成能力(图3)。

图1 成功构建MCP-1过表达MCF-7细胞及空载对照细胞。

图2 MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响

图3 MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞集落形成能力的影响

2.4 MCP-1可以增加MCF-7乳腺癌细胞的迁移能力 本研究采用划痕实验来观察MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞迁移能力的影响。在划痕实验中12 h后MCP-MCF-7细胞的迁移能力开始增强，到48 h时划痕更加明显(图4)。

2.5 MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞凋亡无影响虽然转染MCP-1后细胞有效凋亡百分比(0.57%)低于空载细胞(1.10%)，但是二者之间差异无统计学意义(P＞0.05)(图5)。

2.6 MCP-1下游基因筛选 MCP-1促进乳腺肿瘤细胞增殖转移机制的研究中，笔者采用了RT-PCR及real-timePCR检测p65、p52、FOX1、FOX3、MMP2、STAT2、STAT3、STAT4、RASSF1 mRNA水平的改变。将未作任何处理的MCF-7细胞作为内参，比较EV-MCF-7细胞和MCP-MCF-7细胞中上述基因的改变。实验结果显示p65、MMP2、STAT2基因在MCP-MCF-7细胞中的mRNA水平较EV-MCF-7细胞增高，而RASSF1基因则出现降低(图6)。提示p65、MMP2、STAT2和RASSF1基因有可能是MCP-1的下游基因。

图4 划痕实验法观察MCP-1对MCF-7乳腺癌细胞迁移能力的影响(10×)

图5 AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡检测结果

图6 real-time PCR检测MCP-1下游基因

3 讨 论

炎症可以促进肿瘤的发生发展[1-3]，肿瘤细胞同炎症细胞共同构成了一个特殊的环境——肿瘤微环境(tumor microenviroment)。在这个环境中原本充当人体卫士的炎性细胞失去了其抗肿瘤的作用而成为了肿瘤细胞的营养供给者和转移通道。肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境中最主要的炎性细胞，可以分泌大量细胞及血管生长因子促进肿瘤的生长及转移，同时它本身也可作为载体将肿瘤细胞运送到远处组织，促进肿瘤转移的发生[4-6]。在肿瘤转移灶中它亦可进一步促进转移灶的生长和浸润。

单核细胞趋化因子(monocyte chemoattratant protein-1，MCP-1或CCL2)是趋化血液中巨噬细胞进入局部组织的主要细胞因子[7]。研究证实肿瘤组织及患者血清中MCP-1的水平与乳腺癌患者的预后密切相关[8,15]。但是目前有研究认为MCP-1的促肿瘤增殖转移作用是通过其诱导TAM等炎性细胞进入肿瘤部位后释放各种因子所造成的，而MCP-1本身并不具有促肿瘤增殖和转移的作用[8，13，15]。但是也有很多研究认为MCP-1本身可以促进肿瘤细胞的增殖和转移。Melanie等[16]进行的体外实验中发现侵袭性较高的细胞系MAD-MB-231、BT549、HS578T表达高水平的MCP-1，而低侵袭性的MCF-7和T470则基本不表达MCP-1给予外源性雌激素后，肿瘤细胞内MCP-1的水平明显升高，同时细胞的恶性度增高[17]。用shRNA干扰MDA-MB-231乳腺癌细胞系中MCP-1的表达，发现荷瘤小鼠肺转移灶数量明显减少，约为对照组的1/3[18]。给予荷瘤裸鼠CCL2的中和性抗体后，肺转移灶数量亦明显减少，小鼠生存期延长[19]。

在本研究中笔者发现MCP-1过表达的乳腺癌细胞在接种后第5天时增殖能力出现具有统计学意义的升高(P＜0.05)。在单克隆形成实验中可以观察到接种后14 d MCP-1过表达的乳腺癌细胞所形成的细胞集落数量明显多于EV-MCF-7细胞(P＜0.05)，且在集落形态上亦大于后者。划痕实验则表明MCP-1可以促进乳腺癌细胞的迁移(P＜0.05)。这些结果均提示MCP-1本身即具有促进乳腺恶相肿瘤细胞增殖转移的能力，但它对细胞的凋亡无明显作用。

在对MCP-1下游基因的初步研究中，我们采用了比较MCP-MCF-7细胞和EV-MCF-7细胞real-time PCR结果。研究结果显示MCP-1过表达的乳腺癌细胞中p65、MMP2、STAT2基因的转录水平上调，同时RASSF1基因的转录水平下调，提示MCP-1有可能通过调节这些下游基因而发挥促进肿瘤细胞增殖浸润及转移。在这些下游基因中p65为核因子-核因子过调节这些下二聚体中的一种，研究发现该蛋白可以与多种基因启动子或增强子上NF-中的结合位点特异性结合进而促进该基因的转录。在多种肿瘤细胞的研究均表明NF-点特通过促进细胞周期蛋白D1(CyclinD1)，pRB高磷酸化和G1/S其转换来加速细胞周期的进行，抑制细胞分化，进而导致细胞周期的调节失控使细胞表现为无限增殖和自主分裂状态，导致肿瘤的发生[20-21]。此外NF-2还参与了细胞粘附、血管生成相关细胞因子的转录调节，如细胞间粘连分子(ICAM)、基质金属蛋白-9(MMP-9)环氧化酶-2(COX-2)等。基质金属蛋白作为蛋白水解酶，可以降解细胞外基质及基底膜，是肿瘤侵袭转移过程中最为关键的一步。此外MMP-2也具有促进肿瘤新生血管生成的作用[22-23]。由此可见，MCP-1可以通过对P65、MMP2、下游基因的调节来直接促进肿瘤细胞的增殖转移。STATs为信号转导及转录活化因子，是一类重要的核转录因子，其中STAT1和STAT2细胞凋亡调控有关，而STAT3作为癌基因的一种参与细胞增殖调控[24-25]。RASSF1也是一种可以直接参与细胞周期调控，在体内和体外能抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡的蛋白。RASSF1基因的下调则可减少对细胞增殖的抑制，减少细胞凋亡。但在本研究的凋亡实验中，未发现MCP-1有抑制乳腺肿瘤细胞凋亡的作用，提示可能存在其他信号途径来对抗MCP-1对STAT2和 RASSF1的调节作用。

综上所述，在本研究中我们利用慢病毒载体介导成功构建出可以过表达MCP-1基因的MCF-乳腺癌细胞。通过比较MCP-MCF-7细胞和EV-MCF-7细胞在细胞增殖能力，单克隆集落形成能力、划痕愈合和transwell小室迁移能力，得出MCP-1本身即具有促进乳腺肿瘤细胞增殖转移的能力，而非仅仅依靠其趋化功能吸引TAM等细胞进入肿瘤部位释放各种细胞因子来促进肿瘤的增殖和转移。通过real-time PCR实验，发现MCP-1促肿瘤增殖能力可能是通过调节P65和MMP2基因的转录来完成的。

[1]Schmieder A,Michel J,Schönhaar K,et al.Differentiation and gene expression profile of tumor-associated macrophages[J].Semin Cancer Biol,2012,22(4):289-297.

[2]Saji H,Koike M,Yamori T,et al.Signif i cant correlation of monocyte chemoattractant protein-1 expression with neovascularization and progression of breast carcinoma[J].Cancer,2001,95(5):1085-1091.

[3]Ueno T,Toi M,Saji M,et al.Signif i cance of macrophage chemoattractant protein-1 in macrophage recruitment,angiogenesis,and survival in human breast cancer[J].Clin Cancer Res,2000,6(8): 3282-3289.

[4]Goede V,Brogelli L,Ziche M,et al.Augustin,Induction of inf l ammatory angiogenesis by monocyte chemoattractant protein-1[J].Int J Cancer,1999,82(5):765-770.

[5]Saji H,Koike M,Yamori T,et al.Signif i cant correlation of monocyte chemoattractant protein-1 expression with neovascularization and progression of breast carcinoma[J].Cancer,2001,92(5):1085-1092.

[6]Celis JE,Gromov P,Cabezon T,et al.Proteomic characterization of the interstitial fluid perfusing the breast tumor microenvironment:a novel resource for biomarker and therapeutic target discovery[J]. Mol Cell Proteomics,2004,3(4):327-344.

[7]Dwyer RM,Potter-Beirne SM,Harrington KA,et al.Monocyte chemotactic protein-1Secreted by primary breast tumor sstimulates migration of mesenchymal stem cells[J].Clin Cancer Res,2007,13 (17):5020-5027.

[8]Salcedo R,Ponce ML,Young HA,et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1:directrole of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression[J].Blood,2000,96(1):34-40.

[9]Soria G,Yaal-Hahoshen N,Azenshtein E,et al.Concomitant expression of the chemokines RANTES and MCP-1 in human breast cancer:a basis for tumor-promoting interaction[J].Cytokine,2008,44 (1):191-200.

[10]Lebrecht A,Grimm C,Lantzsch T,et al.Monocyte chemoattractant protein-1 serum levels in patients with breast cancer[J].Tumour Biol,2004,25(1-2):14-17.

[11]Dehqanzada ZA,Storrer CE,Hueman MT,et al.Correlation between serum monocyte chemotactic protein-1 level,clinical prognostic factors,and HER-2/neu vaccine-related immunity in breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2006,12(2):478-486.

[12]Nam JS,Kang MJ,Suchar AM,et al.Chemokin(C-C motif)ligand-2 mediates the prometastatic effect of dysadherin in human breast cancer cell[J].Cancer Res,2007,66(14):7176-7184.

[13]Vitiello PF,Shainheit MG,Allison EM,et al.Impact of tumor-derived CCL2 on T cell efector function[J].Immunol Lett,2004,91 (2-3):239-245.

[14]Zhu J,Jia X,Xiao G,et al.EGF-like ligands stimulate osteoclastogenesis by regulating expression of osteoclast regulatory factors by osteoblasts:implications for osteolytic bone metastases[J].J Biol Chem,2007,282(37):26656-26664.

[15]Chavey C,Bibeau F,Gourgou-Bourgade S,et al.Oestrogen receptor negative breast cancers exhibit high cytokine content[J].Breast Cancer Res,2007,9(1):R15.

[16]Mestdagt M,Polette M,Buttice G,et al.Transacivation of MCP-1/ CCL2 by β-catenin/TGF-4 in human breast cancer cells[J].Int J Cancer,2006,118(1):35-42.

[17]Nam JS,Kang MJ,Suchar AM,et al.Chemokine(C-C motif)ligand-2 mediates the prometastatic effect of dysadherin in human breast cancer cells[J].Cancer Res,2007,66(14):7176-7184.

[18]Salcedo R,Ponce ML,Young HA,et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1:directrole of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression[J].Blood,2000,96(1):34-40.

[19]Soria G,Yaal-Hahoshen N,Azenshtein E,cancer:a basis for tumor-promoting interaction[J].Cytokine,2008,44(1):191-200.

[20]Zhang L,Ruan J,Yan L,et al.Xanthatin Induces Cell Cycle Arrest at G2/M Checkpoint and Apoptosis via Disrupting NF-κB Pathway in A549 Non-Small-Cell Lung Cancer Cells[J].Molecules,2012,17 (4):3736-3750

[21]Mackenzie L,McCall P,Hatziieremia S,et al.Nuclear factor κB predicts poor outcome in patients with hormone-naive prostate cancer with high nuclear androgen receptor[J].Hum Pathol,2012,43(9): 1491-1500.

[22]郭东琳,周红,吴莺,等.核因子κB在凝血因子Ⅶa促进结肠癌SW620细胞增殖迁移中的作用[J].中华肿瘤杂志,2011,33(9): 649-653.

[23]Decock J,Hendrickx W,Drijkoningen M,et al.Matrix metallo protein-ase expression patterns in luminal A type breast carcinomas[J]. DIS Markers,2007,23(3):189-196.

[24]Kin HJ,Park CI,Park BW,et al.Expression of MT-1,MMP-2, MMP-9 and TMP2 mRNAS in ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast[J].Yonsei Med J,2006,47(3): 333-342.

[25]Yao Y,Huang C,Li ZF,et al.Exogenous phosphatidyle-thanolamine induces apoptosis of human hepatoma HepG2 cells via bcl-2/bax pathway[J].World J Gastroenterol,2009,15(14):1751-1758.

Function of MCP-1 in malignant breast carcinoma cells proliferation and metastasis.

LV Ming-li,ZHOU Yun, ZHOU Lei-ping,NIU Jian-mei.Department of Ultrasonography,International Peace Maternity&Child Health Hospital, School of Medicine,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200030,CHINA

Objective To analyze the function of monocyte chemotactic protein-1(MCP-1)in promoting proliferation and metastasis of malignant breast cancer cells.MethodsMCF-7 cells with MCP-1 over-expression and no-load MCF-7 cells(control)were constructed,which were labeled as MCP-MCF-7 and EV-MCF-7 respectively.The CCK8 cells proliferation assay,colony formation assay,scratch assay and cell apoptosis assay were employed to measure the effect of MCP-1 over-expression on MCF-7 cells proliferation,metastasis and apoptosis.Real-time PCR was used to identify candidate downstream genes.ResultsThe MCP-1 over-expressed MC-7 cells and control cell line were successfully constructed.CCK8 assay showed that the absorbance of MCP-MCF-7 at 450 nm was higher than that of EV-MCF-7 from day 5,and the statistical significance was significant(P＜0.05).Colony formation assay illustrated that colony number was significantly higher in MCP-MCF-7 cells than the EV-MCF-7 cells(P＜0.05),and colony volume was larger in MCP-MCF-7 cells.Scratch assay demonstrated that the migratory ability of MCP-MCF-7 cell increased at 12 hours,and wound healing became more evident at 48 hours.The percentage of early apoptotic MCP-MCF-7 cells(0.57%)was lower than that in EV-MCF-7 cells(1.10%),with no statistically significant difference (P＞0.05),which suggested no effect on MCP-1 induced apoptosis in MCF-7 cells.Real-time PCR analysis of the MCP-1 downstream-regulated gene indicated that p65,MMP2 and STAT2 gene were up-regulated,while RASSF1 gene was down-regulated.ConclusionMCP-1 directly promotes breast carcinoma cell proliferation and metastasis.This effect may relate to candidate genes p65,MMP2,STAT2 and RASSF1.

MCP-1;Breast carcinoma cells;Proliferation;Metastasis

R737.9

A

1003—6350(2017)06—0861—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.001

2016-12-16)

国家自然科学基金(编号：81402386)；中国福利会国际和平妇幼保健院优秀青年培育计划

吕明丽。E-mail：great8181@sina.com