两种方法检测丙型肝炎病毒抗体的一致性比较

赵子贤，李娟红，苏宏钊，曾凤群，何健祥

(南方医科大学附属新会医院输血科1、检验科2、耳鼻喉科3，广东 江门 529100)

两种方法检测丙型肝炎病毒抗体的一致性比较

赵子贤1，李娟红2，苏宏钊3，曾凤群2，何健祥2

(南方医科大学附属新会医院输血科1、检验科2、耳鼻喉科3，广东 江门 529100)

目的 用Kappa检验分析两种方法检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗体的一致性，为安全输血提供最佳的HCV抗体筛查方法。方法选取2015年2月至2016年6月在我院就治而有可能需输血患者的丙型肝炎病毒抗体待检标本，用胶体金法HCV抗体检测试剂盒检测，将可疑结果和阳性结果标本再用酶联免疫吸附试验HCV抗体诊断试剂盒(ELISA)和化学发学测定法HCV抗体检测试剂盒CLIA)分别进行复检。用SPSS17.0软件分别对可疑和阳性结果、可疑结果、阳性结果进行Kappa分析一致性程度，并用U检验对Kappa系数进行统计分析。结果胶体金法HCV抗体检测试剂盒检测全部标本共448例可疑阳性和阳性结果，其中112例为可疑结果，336例为阳性结果；用ELISA方法检测448例初检为可疑和阳性结果，结果为阴性、可疑和阳性的例数分别是54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，用CLIA方法检测结果分别为42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)；用ELISA方法检测112例初检为可疑阳性结果，结果为阴性、可疑和阳性的例数分别是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA方法检测结果分别为13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)；用ELISA方法检测336例初检为阳性结果，结果为阴性、可疑和阳性的例数分别是12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA方法检测结果分别为11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。两种方法对可疑和阳性标本、可疑标本、阳性标本的Kappa系数分别为Kappa=0.730(u=16.22，P＜0.01)、Kappa=0.497(u=6.81，P＜0.05)、Kappa=0.705(u=11.56，P＜0.01)。结论两种方法对可疑和阳性标本、阳性标本的检测结果有较好的一致性，而对可疑标本的检测结果一致性为中等，对可疑阳性结果应用更为敏感和特异的试验验证。

丙型肝炎病毒抗体；酶联免疫吸附试验；化学发光测定法；Kappa检验

在临床上丙型肝炎病毒(HCV)感染是一种常见且传染范围比较广的感染性疾病[1-2]。据调查显示，约一半HCV感染患者可转化为慢性肝炎，甚至可转变为肝硬化或肝细胞性肝癌[3]。我国的HCV感染途径主要是经输血传播，特别是反复输入多个献血员的血制品。随着输血医学的发展，输血所带来的感染日益备受重视，一方面是针对患者的早期防治，另一方面是降低医疗纠纷的发生和防止医护人员职业暴露[4]。目前HCV感染的检测方法有胶体金法、ELISA、CLIA和核酸扩增试验法等[5]，各种检测方法因方法学原理不同和商家试剂的灵敏度和特异性不同，使产品说明书中提供的临界值(cut-off)值存在差别[6]，导致同一份标本可能得出不同的检测结果。本文用Kappa检验分析ELISA和CLIA两种方法检测HCV抗体结果的一致性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2015年2月至2016年6月输血前、手术前需检测HCV抗体患者共22 426例，其中男性11 824例(52.7%)，女性10 602例(47.3%)年龄8～92岁，平均(55±18.12)岁。分别用促凝管抽取静脉血，离心获取血清待检。

1.2 仪器与试剂 ①仪器：由瑞士 Tecan Schweiz AG公司生产的全自动酶免分析仪(Freedom EVOLyze)，由北京科美生物有限公司生产的科美东雅化学发光分析仪(CHEMCLI600)；②试剂：由英科新创科技有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒(胶体金法)，由珠海丽珠试剂股份有限公司生产的丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(ELISA法)，由北京科美生物技术有限公司生产丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒(CLIA法)。

1.3 方法 把全部标本先用胶体金法进行初检，将初检结果中的可疑结果、阳性结果平行利用ELISA法和CLIA法进行复检。结果的判断：①ELISA法：临界值(cut-off)=阴性对照平均A值+0.12，样品A值cut-off值为HCV抗体阳性，样品A值＜临界值为HCV抗体阴性。②CLIA法：临界值(cut-off)=2.1×阴性对照发光值(RLU)的平均值，待测样本的RLU值≥cut-off值为有反应性，待测样本的RLU值＜临界值为无反应性。实验操作均严格按试剂说明书进行。

1.4 统计学方法 用SPSS17.0软件包对复检结果进行统计分析。用Kappa检验分析两种方法检测丙型肝炎病毒抗体的一致性，用U检验对Kappa值进行假设检验，以P=0.05为检验水平。0.2＜Kappa≤0.4，一致性水平为一般；0.4＜Kappa≤0.6，一致性水平为中等；0.6＜Kappa≤0.8，一致性水平为好。

2 结 果

2.1 胶体金法初检 2015年2月至2016年6月输血前、手术前需检测HCV抗体患者共22 426例，用胶体金法HCV抗体检测试剂盒进行初检，共448例可疑和阳性结果，其中112例为可疑结果，336例为阳性结果，其余为阴性结果，阳性率为1.50%。

2.2 两种方法平行测试初检HCV抗体为可疑阳性和阳性结果的一致性 胶体金法HCV抗体检测初检的可疑结果和阳性结果共448例，分别用ELISA和CLIA两种方法平行测试复检，ELISA法结果为阴性、可疑和阳性的例数分别为54例(12%)、18例(4%)、376例(84%)，CLIA法结果分别为42例(9.4%)、11例(2.5%)、395例(88.1%)，两种方法针对可疑阳性和阳性结果的Kappa系数为0.730，经U检验，P＜0.01，差异有统计学意义，认为两者一致性强度为好，见表1。

表1 两种方法平行测试HCV抗体可疑阳性和阳性结果的测试结果(n=448，例)

2.3 两种方法平行测试初检HCV抗体为可疑阳性结果的一致性 胶体金法HCV抗体检测初检的可疑阳性结果共112例，分别用ELISA和CLIA两种方法平行测试复检，ELISA法结果为阴性、可疑和阳性的例数分别是11例(9.8%)、30例(26.8%)、71例(63.4%)，用CLIA法检测结果分别为13例(11.6%)、21例(18.7%)、78例(69.7%)。两种方法针对可疑阳性结果的Kappa系数为0.497，经U检验，P＜0.05，差异有统计学意义，认为两者一致性强度为中等，见表2。

表2 两种方法平行测试HCV抗体可疑阳性的测试结果(n=112，例)

2.4 两种方法平行测试初检HCV抗体为阳性结果的一致性 胶体金法HCV抗体检测初检的阳性结果共336例，分别用ELISA和CLIA两种方法平行测试复检，ELISA法结果为阴性、可疑和阳性分别为12例(3.6%)、28例(8.3%)、296例(88.1%)，用CLIA法检测结果分别为11例(3.3%)、19例(5.6%)、306例(91.1%)。两种方法针对阳性结果的Kappa系数为0.705，经U检验，P＜0.01，差异有统计学意义，认为两者一致性强度为好，见表3。

表3 两种方法平行测试HCV抗体阳性的测试结果（n=336，例）

3 讨 论

由HCV感染引起的丙型肝炎是我国比较常见的传染病之一，它主要通过输血传播并且对人类健康造成极大危害。目前绝大多数医院开展了HCV检测，只要用于输血前、术前、怀孕前检查等[7]。调查研究显示，我国每年新发现的丙型肝炎患者大约35 000例，并且北方发现的病例要比南方高，抗HCV阳性率伴随着年龄的增大而上升，男女之间差异无统计学意义[8]。患者感染HVC后，临床症状不明显，易发展为慢性而导致成为肝硬化或肝癌[9]。部分HCV携带患者因没有早期诊治，在不知情下献血或手术等方式传播，因此需对HCV感染患者进行早期诊断[10]。胶体金法检测HCV抗体，操作简便，省时，无需用特殊仪器，费用相对低，而且有较高的灵敏度和特异性，可用于紧急情况下的初筛[11]。对于免疫系统正常的患者用ELISA法检测HCV抗体，其检出率可达99.0%，缺点是任何的污染均容易产生假阳性结果。用人工合成多肽抗原或用基因工程制造的多肽作为固相的ELISA诊断试剂盒，利用间接法原理检测，使不同制造商的测定结果存在较大的差异[12-13]。由于HCV基因序列容易变异而使其所编码的氨基酸序列有显著改变，国内许多患者感染的HCV有多种基因型而且存在一定比例的混合感染，导致HCV的早期诊断效果并不理想。CLIA法具有无放射污染、标记物的来源多样并且有效期长、检测灵敏度高、检测方便等优点，目前使用较多。其检测效果与酶标记物的质量好坏相关，也跟纯度好、亲和力高、活性强的酶和抗原或抗体密切相关[14-15]。增强剂可以提高发光信号使发光时间进一步延长，这样对提高检测的灵敏度有极大的帮助。有文献表明，与常规的ELISA法相比，CLIA法的灵敏度提高了3～5个数量级[14]。

本文通过研究发现利用多种方法对HCV抗体待检标本进行检测，有时会出现不同的结果，特别是处于阳性临界值的标本。用ELISA法和CLIA法对金标法初检448例可疑阳性和阳性结果、336例阳性结果进行平行检测，用Kappa检验分析其结果的一致性显示好；然而两种方法对金标法初检112例HCV抗体可疑阳性结果时，Kappa检验分析其结果的一致性显示中等。原因可能是生产检测HCV抗体试剂盒的商家使用不同的HCV基因重组抗原或抗原各区段、比例不相同，使不同商家的试剂灵敏性和特异性存在差异，抗HCV抗体的检测结果也不尽相同[16-17]。另外抗HCV抗体存在假阳性的情况，如ELISA和CLIA试剂所用抗原是基因工程制备的蛋白，来自载体大肠杆菌的一些序列或与血清中的大肠杆菌因子发生反应从而产生假阳性；或因受检者血清中的IgG浓度过高，其吸附在板孔的能力过于强大，降低本底较困难，从而产生假阳性；或因受检者本身存在结缔组织病，如多发性骨髓瘤等，血清中的异常IgG浓度过高或系统性红斑狼疮血清中的风湿小体浓度过高，致使出现假阳性[18]。因此，只用一种试剂判断HCV阳性需小心，HCV筛查可疑或阳性仍需通过更为特异的试验确认。目前HCV的确证试验多用HCV-RNA和重组免疫印迹法(RIBA)。HCV-RNA法检测步骤繁琐，容易有交叉污染导致假阳性，另外试剂和仪器偏贵；RIBA法有很高的特异性，但试剂价格同样贵，两者均难以在临床上推广。已有研究对临床上诊断HCV感染的不同复检核审模式进行了探讨[19-20]。

综上所述，两种方法检测初检(金标法)为可疑阳性和阳性标本、阳性标本有较好的一致性，但只针对可疑阳性标本时，一致性为中等。为了保证用血安全，减小医疗纠纷和待检者的心理负担，在工作中遇到HCV检测可疑结果时，要选用其他特异性更高的方法进行验证。

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Comparison of the concordance of two methods for the detection of anti-HCV.

ZHAO Zi-xian1,LI Juan-hong2,SU Hong-zhao3,ZENG Feng-qun2,HE Jian-xiang2.Department of Blood Transfusion1,Department of Laboratory2, Department of ENT3,Xinhui Hospital Affiliated to Southern Medical University,Jiangmen 529100,Guangdong,CHINA

Objective To evaluate the concordance of the two methods for detection of antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV),and to provide the best HCV antibody screening method for safe blood transfusion.MethodsAll the anti-HCV inspected samples which were collected from the patients,who admitted to our hospital for treatment and underwent blood transfusion from February 2015 to June 2016,were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method.The suspicious and positive samples were re-inspected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and chemiluminescent immunoassay(CLIA).Kappa consistency analysis of the re-inspected results of suspicious and positive specimens was carried out with SPSS17.0 software,and the Kappa coefficient was statistically analyzed byUtest.ResultsA total of 448 suspicious and positive samples were detected by HCV antibody detection kit with colloidal gold method among all the samples,which included 112 suspicious and 336 positive specimens.The negative, suspicious,positive specimens re-inspected out by ELISA in 448 samples were 54(12%),18(4%),376(84%),respectively;The negative,suspicious,positive specimens re-inspected out by CLIA in 448 samples were 42(9.4%),11 (2.5%),395(88.1%),respectively.The 112 suspicious samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious, positive specimens were 11(9.8%),30(26.8%),71(63.4%),respectively;The re-inspected results by CLIA showed that negative,suspicious,positive specimens were 13(11.6%),21(18.7%),78(69.7%),respectively.The 336 positive samples re-inspected by ELISA showed negative,suspicious,positive specimens were 12(3.6%),28(8.3%),296 (88.1%),respectively.The re-inspected results by CLIA were 11(3.3%)negative,19(5.6%)suspicious,306(91.1%) positive,respectively.Kappa coefficient of suspicious-positive specimens,suspicious specimens and positive specimens by the two assays of anti-HCV were 0.730(u=16.22,P＜0.01),0.497(u=6.81,P＜0.05),0.705(u=11.56,P＜0.01), respectively.ConclusionThere is a good consistency of suspicious-positive and positive specimens by the two assays of anti-HCV.The consistency of the two assays for suspicious specimens was medium,and other more sensitive and specific methods should be used in the suspicious specimens.

Antibodies to hepatitis C virus(anti-HCV);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);Chemiluminescence immunoassay(CLIA);Kappa test

R512.6+3

A

1003—6350（2017）06—0928—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.023

2016-08-27)

赵子贤。E-mail：224047632@qq.com