结核分枝杆菌Rv2181T、B细胞表位预测及分析

占卫红，吴启航，赵隆麒，王心倩，孙 妍，余晓丽

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

结核分枝杆菌Rv2181T、B细胞表位预测及分析

占卫红，吴启航，赵隆麒，王心倩，孙 妍，余晓丽

(武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023)

预测和分析结核分枝杆菌Rv2181抗原的T细胞表位和B淋巴抗原表位的分布状况。首先从NCBI中得到蛋白的氨基酸序列，接着通过BLAST将人类蛋白和得到的序列进行同源性分析，使用SYFPEITHI对MTB中Rv2181蛋白的T淋巴细胞抗原表位，取得分在前2%的多肽作为优势抗原，然后用NETCTL、NetMHC和BIMAS等数据库预测抗原CD8+T和CD4+T细胞表位，综合结果筛选出优势肽段。利用Protean预测到的B细胞抗原表位，再根据IEDB、ABCpred、Bcepred等数据库预测，排除α-螺旋、β-折叠内不易形成表位的序列，将位于β-转角、无规则卷曲处的表位确定为优势表位。通过预测、分析，筛选出Rv2181抗原CD4+T细胞表位中强结合表位120个，弱结合表位495个，综合CD4、8+T的预测，最终筛选出1个优势表位肽段,确定7条优势的B细胞抗原表位区域。预测T、B细胞候选表位为结核病诊断和治疗有重要价值。

结核分枝杆菌；Rv2181；T细胞；B细胞；表位分析

1 引言

一个世纪以来，结核病作为一种对人类的生命安全具有严重威胁的传染病，越来越多的人开始关注它对人类造成的健康问题。据世界卫生组织估计,有860万人感染,130万人死于这种疾病[1]。近年来，通过研究人员的辛勤探索和不断追寻，结核病的检测手段和与它相关的抗结核药物都在日新月异的变换着，但是加强对结核病诊断以及开发新的、有效的抗结核疫苗依旧是结核病研究的热点。目前，卡介苗(BCG)是唯一一种较为广泛用来预防结核病的疫苗，但是卡介苗只能预防幼儿肺外血源播散性结核[2],对成年人起到的的保护效力并不高[3]，甚至疫苗对部分成年人起不到保护作用,更加严峻的是，随着多重耐药的结核患者的出现，治好结核耐药患者的失败率在一般敏感性结核病高出80倍[4]。随着生物化学、免疫学和分子生物学等学科的研究进步,发现有部分结核分枝杆菌的抗原可能在提高结核病诊断能力或研制新的疫苗方面具有重要作用[5]。有研究发现结核分枝杆菌基因组的保守性相对较高,且其中的T/B细胞抗原表位序列具有更高的保守性,甚至可能在机体免疫识别过程中受益。这给我们研究和开发新的抗结核分枝杆菌疫苗带来挑战,需要对相关现象进行更深入和系统的研究。

抗原表位是通过与抗体或者细胞表面的抗原受体结合而发挥免疫效应。一个蛋白质抗原的表位,不仅包含B细胞表位，辅助性、细胞毒性T细胞表位，还有自然杀伤细胞表位。这些与免疫识别密切相关的结构，同时也有不利于保护性免疫作用的结构。因此筛选和鉴定蛋白抗原优势抗原表位对了解结核分枝杆菌的致病机制、改进免疫学诊断方法以及新型、安全的疫苗开发有重要价值[6]。

2 材料与方法

2.1 同源性分析比对

在NCBI数据库中获得MTB的Rv2181的蛋白序列(GeneID：888269、428aa) 。

在NCBI数据库中用Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 将Rv2181的蛋白序列与结核分枝杆菌复合群的蛋白序列进行同源比对分析。登入NCBI选择protein Blast，然后选择非重复蛋白序列Non-redundant protein sequences ( nr ) 数据库，并提交Rv2181抗原序列，分析抗原序列与MTB复合群、非结核分枝杆菌以及其他细菌的同源性；然后选择人类Human进行分析。

2.2 Rv2181抗原的CD4+T细胞表位预测

登录NetMHCⅡpan 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/),来预测MHCⅡ中的分子。选择DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501和DQA1*0301-DQB1*0302作为HLAⅡ类分子的限定条件预测结果。根据表位多肽与HLA分子结合能力的强弱，分为较强结合(KD<50 nM)与较弱结合(KD<500 nM)[7]。

2.3 Rv2181抗原的CD8+T细胞表位预测

2.3.1 NetMHC表位预测

登录NetMHC ⅡPAN 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/),该软件可预测分析HLA-ABCE类别的MHC分子。由于多数HLA分子偏向于和九个氨基酸长度的多肽有强结合，所以选择氨基酸长度为9个，并选择可能性最大的HLA-A (A2)以及(A3)两类HLA分子作为限定条件[8]。

2.3.2 SYFPEITHI表位预测

SYFPEITHI是一个主要组织相容性复合体的数据库，可以进行针对MHC等位基因的产物的配体进行预测。进入网站,选择HLA- A* 02:01、 A* 03:01两类，多肽长度选为9个氨基酸，提交序列，记录分析得分在前2%的多肽序列[9]。

2.3.3 BIMAS表位预测

进入BIMAS网站(http:// www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/),BIMAS是依据多肽分子与HLAⅠ类分子解离所用时间的一半进行排序，其分析结果是依据系数表推导的。选择 HLA*0201及A3 两类分子，多肽长度选为9个氨基酸[10]，接着输入Rv2181的氨基酸序列并提交，进行预测分析。

2.3.4 NetCTL表位预测

登入NetCTL网站( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/) ，从选择类别中，选定A2和A3两个超类型，Weight on C terminal cleavag值填写为“0.15”，以及 Weight on TAP transport efficiency填写为“0.05”，Threshold for epitope identification填写为“0.75”，而后输入Rv2181的氨基酸序列，进行预测。预测结果是以得分高低来分别显示敏感度和特异度的高低。最后，对预测肽段的得分超过0.75的进行记录分析[11]。

2.4 Rv2181蛋白抗原的B细胞表位预测

将MTB的Rv2181的蛋白质氨基酸序列单独保存成*.fas格式，启动Protean程序，以FASTA文件格式打开。我们采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Karplus-Schulz的柔韧性方案、Emini的表面可及性方案和Jameson-Wolf的抗原指数方案综合性预测，预测蛋白质的二级结构，排除α-螺旋、β-折叠内不易形成表位的序列，将位于β-转角、无规则卷曲处的表位确定为优势抗原表位。再根据IEDB、ABCpred、Bcepred等软件综合分析，确定最佳抗原表位候选区域。

3 结果

3.1 Rv2181抗原同源性比对结果

Rv2181抗原与结核分枝杆菌复合群蛋白的同源性都达到100%；与非结核分枝杆菌蛋白同源性比对的一致性为71%-82%，其平均值为76.5%。Rv2181抗原与结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌相比较，Rv2181的抗原与前者的同源性较高。从表1中看出Rv2181抗原序列与人类蛋白同源性仅有31%。通过以上结果可以得出Rv2181抗原与结核分枝杆菌复合群的同源性相当高，然而与人类蛋白的同源性很低，所以认为Rv2181抗原可能有作为免疫性结核病疫苗的能力，因此继续对其进行预测分析很有必要。

表1 抗原Rv2181与人类蛋白同源性的比较结果

蛋白最高评分期望值同源性Rv218132．73．031%

3.2 Rv2181抗原T细胞表位结合预测结果

3.2.1 Rv2181抗原表位预测结果

使用NetMHCⅡpan 3.1 server对抗原CD4+T细胞表位进行预测分析，选择DRB1*0901、DRB1*1501、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*0301、DRB1*0405、DPA1*0103-DPB1*0401、DPA1*0201-DPB1*0101、DQA1*0101-DQB1*0501、DQA1*0301-DQB1*0302作为限定条件，预测结果见表2。从预测结果可以知道不同HLA分子结合数目大相径庭，就拿Rv2181抗原与DRB1*1101强结合的数目明显较多，与DQA1*0301-DQB1*0302结合的数目最少。与不同HLAⅡ分子强弱结合的数目可见表2。

表2 NetMHCⅡ对Rv2181抗原的CD4+T细胞表位分布的预测结果

HLAⅡ分子强结合肽段数弱结合肽段数DRB1∗09011369DRB1∗15011762DRB1∗0701553DRB1∗11011830DRB1∗03011438DRB1∗0405531DPA1∗0103⁃DPB1∗04011750DPA1∗0201⁃DPB1∗0101、1532DQA1∗0101⁃DQB1∗05011659DQA1∗0301⁃DQB1∗0302071

3.2.2 Rv2181CD8+T表位预测结果

选择HLA-0201和HLA-0301作为限定条件，对Rv2181抗原使用NETCTL、SYFPEITH、NetMHC和BIMAS这4种不同在线预测软件进行预测。综合结果，得出Rv2181抗原预测出4条抗原表位多肽，结果见表3。

表3 Rv2181抗原CD8+T细胞表位的综合分析

起始位置序列NETCTLSYFPEITHINetMHCBIMS亲和值得分得分亲和值得分得分20CLLWLLAGV0．25501．14243016．65强结合591．888112LLIASTAIV0．45401．23332821．81强结合48．478265NIAGALARL1．0880．8102281081．20弱结合6．75617VLWCLLWLL1．34001．3579274．85强结合5199．555

注：亲和值越低表明结合能力越强，得分越高表示结合能力越强。

3.2.3 Rv2181 CD8+T和CD4+T表位综合预测结果

通过在线预测工具的结果，得出Rv2181抗原的CD4+T与CD8+T的肽段。最后根据CD4+T细胞表位的肽段包含CD8+T细胞表位的肽段的原则，预选出Rv2181有1条优势表位肽段，结果见表4。

3.3 Rv2181抗原的B细胞表位预测和分析结果

3.3.1 单参数方案预测的抗原表位

Protean软件预测的抗原表位见表5。

表4 Rv2181抗原的CD4+T和CD8+T细胞表位综合分析

蛋白位置序列CD4+T表位肽段CD8+T表位肽段14～28GRRVLWCLLWLLAGVVLWCLLWLL

3.3.2 B细胞优势抗原表位的确定

综合DNAStare中的Protean和蛋白质的二级结构分析初步得到B细胞抗原表位，根据IEDB、

表5 单参数方案预测的抗原表位

预测方法预测表位Hydrophilicity(Kyte⁃Doolittle)1～17、38～66、126～143、181～192、213～220、239～257、261～268、275～284、303～308、327～334、346～353、370～390、409～427Flexibility(Karplus⁃Schulz)8～15、59～68、128～133、158～163、182～190、201～204、214～218、252～255、261～266、276～279、305～309、373～380、411～425Accessibility(Emini)13～16、41～45、60～63、81～84、183～191、214～219、239～256、261～267、277～283、306～309、346～353、373～380、409～427AntigenicIndex(Jameson⁃Wolf)4～18、41～50、57～69、127～134、138～144、159～164、180～192、213～221、239～247、251～258、263～268、276～283、302～310、326～333、346～353、373～380、410～427

Bcepred等软件综合预测后得到的结果，排除α-螺旋、b-折叠内不易形成表位的序列，将位于-转角、无规则卷曲处的表位确定为优势抗原表位，最终确定的最佳抗原表位候选区域有7条，结果见表6。

表6 B细胞优势抗原表位

表位氨基酸序列4～12WRAPEVGSR41～46TPYRID57～62WLDGRP183～189RRTPWPR251～257HTDRIGA373～379PQHRETT409～428RMTPQRSLTRGLTPAPTAS

4 讨论

在近些年的研究中，许多特异性结核抗原被研究人员发现，这结果为结核疫苗的研制提供了一些研究基础[12]。许多新的疫苗也在动物实验中取得较好的实验结果，但是仍然存在许多能被T细胞所识别的结核菌的蛋白抗原有待发现。传统疫苗是将病原体灭活或减毒而制成的，存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。表位疫苗(Epitope vaccine)是用抗原表位制备的疫苗，包括合成肽疫苗、重组表位疫苗及表位核酸疫苗是目前有关传染性疾病和恶性肿瘤疫苗的研制方向。 由于表位仅是蛋白抗原的一部分，其分子量较小，免疫原性较弱，不能刺激机体产生较强的免疫应答，因此为增强其免疫原性，可将表位与载体蛋白如牛血清白蛋白或破伤风类毒素等相偶联，其所产生的保护力可与大分子相比。另外也可将多种T、B细胞表位的氨基酸连接于分支状的多聚赖氨酸骨架上形成一种具有独特三维空间结构的大分子多抗原肽疫苗，因包含多种特异性的表位，而具有更有力的保护[13]。目前基因疫苗可作为预防和治疗性疫苗，而研究中发现常规疫苗肌注后诱导的免疫应答较弱，因此找到新的基因疫苗设计方案已成为研究的热点之一[14-15]。徐焕宾等将鸭乙肝病毒Pre-s中的P127-138B细胞表位基因克隆到含多肽表达盒的载体中，体外转染肌肉细胞，并经动物试验证实重组的载体可在体外瞬时高效表达，并保持原有的免疫活性，结果提示以B细胞表位为基础的基因疫苗可以诱导特异性体液免疫应答，同时显示出显著的MHC限制性[16]。虽然表位疫苗具有许多优点，并且其研究也取得了重大的进展，但仍存在一些问题。比如将多肽单独应用的免疫原性较低，如何诱导出最佳的免疫应答是我们需要去解决的难点之一，此问题或许可以通过构建包含多种限制性表位的疫苗来解决[17]。在未来的研究中，我们应当加大对结核表位的研究，研制出具有效价、便捷的疫苗。

笔者对MTB的Rv2181蛋白抗原中T、B细胞表位预测分析是通过生物信息学的方法进行预测。首先得到Rv2181蛋白的氨基酸序列，接着通过对人类蛋白和Rv2181蛋白序列进行同源性分析，使用SYFPEITHI、NETCTL、NetMHC和BIMAS等数据库预测抗原T细胞中CD8和CD4T的表位，综合结果筛选出一条优势肽段GRRVLWCLLWLLAGV。利用Protean预测到的B细胞抗原表位，再根据IEDB、ABCpred、Bcepred等数据库预测，排除α-螺旋、β-折叠内不易形成表位的序列，将位于β-转角、无规则卷曲处的表位确定为优势表位[17]。通过预测分析来筛选出7条优势的B细胞抗原表位区域，Rv2181蛋白可作为新的结核病诊断试剂和疫苗研发的候选靶蛋白。

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Prediction and analysis of T，B cell epitopes’ s distribution of theMycobacteriumtuberculosisRv2181

ZHANWei-hong,WUQi-hang,ZHAOLong-qi,WANGXin-qian,SUNYan,YUXiao-li

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytecnic University,Wuhan 430023,China)

To forecast and analyse the distribution of CD4+T cell CD8+T cell and B epitope encoded by the Rv2181 ofMycobacteriumtuberculosis.First obtain the protein amino acid sequence from NCBI detabase,and then analyse its homology with human proteins sequence and homology.Using SYFPEITHI to analyse T cell antigen epitope, choosing the points in the top 2% as advantage epitope.Then using NETCTL, NetMHC and BIMAS database to predict CD8+T CD4+T cell epitope, to screen out advantage peptides from prediction results.Protean are used to get the predicted B cell antigen epitope, and according to IEDB, ABCpred, Bcepred detabases, eliminate the sequences which have alpha helix, beta - fold,but choose the sequences in beta angle, the table level random curl as advantage epitope.By predicting, there are 120 strong and 495 candidates epitope in CD4+T cell.In the end, select one dominant epitope,and determine 7 B cell advantages antigen epitope area.The prediction of T ,B cells in the diagnosis and treatment of tuberculosis is of improtant value.

Mycobacteriumtuberculosis; Rv2181; T cells; B cells; epitope analysis

2017-01-26.

占卫红(1992-)，女，硕士研究生，E-mail: 3051361453@qq.com.

余晓丽(1963-)，女，教授，E-mail:yxll268@126.com.

2095-7386(2017)01-0039-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.008

Q 93

A