肝癌细胞外泌体蛋白组成分析

宋蕙晨，李伟利，褚丹萍，李大蒙，李菁，张玉婧

（医药生物技术国家重点实验室，化学生命科学合作创新中心，江苏省小核酸生物学和生物技术工程研究中心，南京大学生命科学高等研究院，生命科学学院，南京大学，仙林大道163号，江苏南京，210023，中国）

肝癌细胞外泌体蛋白组成分析

宋蕙晨，李伟利，褚丹萍，李大蒙，李菁，张玉婧

（医药生物技术国家重点实验室，化学生命科学合作创新中心，江苏省小核酸生物学和生物技术工程研究中心，南京大学生命科学高等研究院，生命科学学院，南京大学，仙林大道163号，江苏南京，210023，中国）

外泌体是细胞分泌的一种大小40-130nm的双层膜结构的微小囊泡。近年来，研究发现外泌体可以携带蛋白质，DNA，RNA，miRNA和脂类物质等，通过对这些物质的运输，介导细胞与细胞之间，组织与组织之间的相互作用，成为新的信号传递载体。并且最近发现，肿瘤细胞分泌的外泌体可以率先改变靶组织的微环境，进而介导肿瘤细胞的迁移，实现癌症的转移。因此对肿瘤细胞的外泌体蛋白分析非常重要，本文首次分析了肝癌细胞的外泌体蛋白组成，为研究肝癌细胞外泌体的作用和机制，以及肝癌转移打下基础。

外泌；蛋白质；肝癌；HEPG2 细胞

引言

外泌体是一种直径为30-100nm的内含体起源的囊泡，其内部包含有蛋白质、脂质、RNA和DNA。它最早被发现于1987年，Johnstone等人在网织红细胞分化过程中发现了它们在多泡体（MVB）的融合过程中被从细胞质膜里释放出来[1]。十年以后，在B淋巴细胞和树突细胞中同样发现了这种内含体来源的小泡[2,3]。接下来越来越多的研究者在不同的细胞中都观察到外泌体的分泌。

越来越多的研究发现外泌体在生理病理过程中起着重要的作用，外泌体可以通过表面的蛋白或和有生物活性的脂质配体与受体细胞相互作用以配受体结合的方式直接激活细胞表面受体，也可以将其表面的受体或内含的效应物质（包括转录因子、原癌基因和感染性颗粒）运送至受体细胞内。此外，被包裹在EV内的包括mRNA和小调控RNA（例如miRNA和其他非编码RNA）在内的多种RNA分子也会被递送至受体细胞内进而影响受体细胞的活性与功能[4-9]。对外泌体进行高通量蛋白组学分析结果显示外泌体表面含有细胞外基质和细胞表面蛋白（如胶原蛋白，整合素以及半乳糖凝集素）、细胞表面受体（如血小板衍生生长因子受体（PDGFR）和表皮生长因子受体（EGFR）），其内包含各种信号通路中的蛋白、细胞内细胞骨架成分、代谢相关的酶以及G蛋白[10,11]。除此以外，外泌体还含有一些特异性的蛋白质与其来源细胞相关，这些蛋白也参与对靶细胞的功能调节，此外对这些蛋白的检测还可以用于临床上对疾病发生的检测。最近，研究发现肿瘤细胞分泌的外泌体表面的整合素可以和靶细胞相互作用，通过改变靶组织的微环境进而促进肿瘤细胞的远端转移[12]。因此，研究外泌体的蛋白质组成对研究细胞、组织、器官之间的相互作用至关重要。

在《全球癌症报告2014》显示，中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。目前，我国肝癌的发病率约为25.7/10万，成为死亡率仅此于胃癌、肺癌的第三大恶性肿瘤，但是肝癌的发病机制尚不明确。外泌体在癌症的发病过程中发挥着重要的作用，对免疫系统的激活，肿瘤免疫逃逸，以及肿瘤的远端转移过程都发挥着重要的作用。目前，肝癌细胞的外泌体蛋白结构和组成尚未明确，本课题通过对但癌细胞的外泌体进行蛋白质谱分析，研究肝癌细胞外泌体的蛋白质结构和组成，分析其可能的成分与功能，为外泌体在肝癌发病过程和远端转移的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养方法

HEPG2细胞系培养于含有10%胎牛血清（FBS），1%双抗(PS)的高糖DMEM培养液中，其培养条件为37℃，5%二氧化碳的环境。约两天传代一次，按贴壁细胞的传代方法进行传代。

当需要从细胞培液中收集外泌体时，细胞传代后待其密度至80%后，弃去之前的培养液，用温热的HBSS清洗细胞2次，更换培液为含1%FBS(exosome free)的OPTI-MEM培养液，37℃，5%二氧化碳的环境培养24-36小时，培养时间视细胞状态而定。

1.2 去除FBS中的外泌体

为避免FBS中的外泌体对实验结果产生干扰，使用差速离心的方法将FBS中的外泌体去除，分别通过3000g 30分钟，10000g 1小时，110000g 2小时离心去除沉淀后使用0.22μm的滤器过滤，除菌以及除去可能残留的大颗粒杂质，分装冻存备用。

1.3 从细胞培液中提取外泌体

本实验使用购买自Invitrogen公司的从细胞培液中分离外泌体的试剂盒（exosome isolation kit for culture medium）对HEPG2 培液中的外泌体进行分离，通过3000g 30分钟，10000g 1小时，离心去除沉淀，再使用110000g 2小时弃去上清，用HBSS缓慢轻柔的清洗沉淀2至3次即得到较为纯净的外泌体。根据用途，用适量HBSS重悬沉淀用于纳米颗粒计数或RNA的提取。加入适量RIPA裂解液用于提取外泌体蛋白。加入8M的尿素裂解液用于液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析。

1.4 外泌体的计数

将分离得到的外泌体重悬后，测定蛋白浓度调整至5μg/ ml,再稀释100至500倍后加入仪器中检测。

1.5 外泌体中蛋白质的抽提

在冰上向离心得到的外泌体沉淀中加入适当的量的冰冷的RIPA裂解液或8M的尿素裂解液，充分吹打并转移至新的EP管中，并在冰上静置20分钟后12000g，4℃离心5分钟，取上清，得到裂解的蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，样品保存在-20℃或-70℃中。

1.6 LC-MS/MS

LC-MS/MS是液相色谱串联质谱，是一种高通量的蛋白定性分析方法。它的原理是将样品中的蛋白都消化成一定长度的肽段，经过液相色谱的纯化分离并在两级色谱中通过肽段以及氨基酸间的分子量差异计算得到肽段序列。得到的肽段序列与已知蛋白数据库的蛋白序列进行计算机比对从而鉴定出样本中所含的蛋白质种类。由于近几年LC-MS/MS技术发展迅速，现已成为一种常用的高通量的蛋白定性分析手段。具体方法如下：

1.6.1 蛋白的消化与脱盐

蛋白混合物在被还原和烷基化后在37℃下使用Lys-C消化6小时。使用25 mM 的碳酸氢铵将蛋白裂解液中的尿素浓度调整为1M。按1:50的比例向调整过的蛋白溶液中添加测序级别的胰蛋白酶，37℃下消化过夜。使用蚁酸进行终止消化使其终浓度为0.1%。消化后的肽段混合物20000g离心10分钟，收集上清液准备进行脱盐。

使用Waters Oasis HLB 固相萃取小柱对肽段进行脱盐。先用1ml的甲醇和ml的乙腈过柱，然后连续3次使用1ml的0.1%的蚁酸过柱，接下来将样品分3次上柱。连续三次使用1ml 0.1%的蚁酸过柱子进行脱盐。使用连续浓度的乙腈对样品进行洗脱，依次为：0.5 ml 40%乙腈/0.1%的蚁酸和0.5 ml 60%乙腈/0.1%的蚁酸，将合并的洗脱物减压离心浓缩。

1.6.2 在线高pH值分级分离

浓缩的样品被溶解在高pH分级缓冲液A中（98%水/ 2%乙腈，用氨水调节pH为10），将样品载入XBridge C18基础反相液相色谱柱中。蛋白肽段在Rigol L-3000液相色谱系统中用AB缓冲液体系分离（缓冲液B梯度的步骤如下：5-8%5分钟，8-18% 35分钟，18-32% 22分钟，32-95% 2分钟和95% 4分钟）。每90秒收集一次洗脱液，总共可以得到42份洗脱液。这42份洗脱液被按1、15、29和2、16、30依次类推的顺序整合为14个组分。这些组分接下来被用于质谱分析。

1.6.3 LC-MS/MS分析

样品使用反相液相色谱系统EASY-nLC 1000偶联纳米电喷雾源链接Q Exactive质谱。蛋白肽段使用buffer A(0.1%蚁酸)和Buffer B（乙腈/0.1%蚁酸）缓冲液体系线性梯度分离78分钟，流速为280nL/min。洗脱的肽段被直接被电喷雾离子化，然后进入质谱分析，电喷雾参数为2.0kV，毛细管温度320°C。质谱按照数据相关模式工作，采集调查扫描分辨率为70000, AGC目标为3E6个离子，最大离子注入时间60ms。随后，选取前20个含量最丰富的峰碎片化后进入2级质谱，碎片化所需的校正后的碰撞解离碰撞能为27。二级谱的分辨率为17500，目标值为5E4个离子，最大离子注入时间60ms。为了最大限度地减少肽段的重测序，动态排除窗口时间被设置为50秒。

1.6.4 原始MS数据的分析

原始数据的分析采用Proteome Discoverer结合SEQUEST作为搜索引擎。MS/MS质谱信息的搜索数据库为UniprotKB人蛋白数据库（下载于2015年5月11日）并使用已知的常见外源蛋白污染物数据库进行补充。半胱氨酸的末端甲基化修饰被设置作为固定修饰，N-末端乙酰化和甲硫氨酸氧化被设为可变修饰。肽段分子量和碎片分子量的容差分别设定为10 ppm和20 mDa，序列匹配的容差为最大2个错误的切割位点。肽段的鉴定通过1%FDR筛选。

1.7 基因的GO分析和KEGG通路分析

为了对鉴定到的基因进行基因本体功能聚类以及信号通路的功能聚类，我们对得到的数据进行GO分析和KEGG分析。使用的工具是DAVID数据库(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery Bioinformatics Resources 6.7)。网站地址：http://david.abcc.ncifcrf.gov/。详细信息和具体实验方法参照文献[13,14]。

2 结果

2.1 利用LC-MS/MS鉴定HEPG2分泌的外泌体蛋白质

为了鉴定HEPG2细胞来源的外泌体中的蛋白质组成，我们使用外泌体分离试剂盒从HEPG2细胞培养液中分离外泌体。将外泌体重悬浮于HBSS后，用0.22μm的PVDF膜滤器除去可能存在的污染物。然后将纯化的外泌体用外泌体分离试剂盒重新离心并制样，随后使用LC-MS/MS对HEPG2来源的外泌体的蛋白进行定性鉴定。我们准备了3份独立实验样品进行质谱检测并对原始数据进行数据库搜索，三个外泌体样本分别检测出2858,2537和2928种蛋白质。如文氏图中所示（图1），三次实验的交集被认为是最终的鉴定结果。因此，共1610种蛋白在HEPG2细胞的外泌体中被检测出。

图1 LC-MS/MS鉴定HEPG2来源外泌体的蛋白质

2.2 HEPG2分泌的外泌体蛋白质GO分析

为了分析HEPG2分泌的外泌体蛋白质的功能，我们利用PANTHER数据库(http://www.pantherdb.org/)对外泌体来源的蛋白进行GO分析，按照蛋白质分类、细胞组成、生物学过程和分子功能对鉴定出的蛋白质进行聚类（图2）。通过对HEPG2外泌体蛋白进行分类，我们发现HEPG2外泌体蛋白种类非常丰富，达25种，其中最丰富的为核酸结合蛋白（17%），酶调节因子（11%），水解酶（10%），转移酶（8%），细胞骨架蛋白（6%），氧化还原酶（6%），受体（6%）等（图2A）。为了进一步分析这些蛋白可能来自于细胞的什么部位，我们进行了细胞组成分析（图2B），我们发现这些蛋白主要来自细胞部分（39%），细胞器（25%），大分子复合体（20%），细胞外区（6%）与细胞膜（6%）以外，还有少量存在于细胞外基质（2%）。为了进一步分析HEPG2外泌体蛋白的功能，我们进行了生物学功能分析（图2C），我们发现HEPG2外泌体蛋白主要参与细胞过程（30%）与代谢过程（26%），此外还有部分蛋白质参与定位（9%），细胞组分的组织或生物学合成（9%），刺激应激反应（6%）与生物调控（6%）等。对这些蛋白自身的功能聚类之后（图2D），我们发现，这些蛋白中有42%的蛋白是具有催化活性，34%的蛋白是与结合相关的，11%的蛋白具有分子活性，除此以外，还有少量的转运蛋白活性（5%），受体活性（4%），翻译调节因子活性（2%），信号转导活性（1%）与抗氧化活性（1%）。所有的结果说明HEPG2外泌体蛋白质组成非常丰富，有可能参与靶器官多种生物学过程的调控。

图2 HEPG2来源外泌体的蛋白质GO分析

2.3 HEPG2分泌的外泌体蛋白质KEGG Pathway分析

为了进一步分析HEPG2分泌的外泌体蛋白质可能参与那些信号通路的调控，我们在DAVID(http://david.abcc.ncifcrf. gov/)数据库中对外泌体来源的蛋白进行KEGG Pathway分析，对鉴定出的蛋白质进行聚类（图3），聚类结果用-log10（P值）表示，数值越高说明鉴定的蛋白质在该条目富集的越显著。有趣的是，我们发现核糖体（57.41）和蛋白酶体（55.26）相关信号通路的蛋白质富集程度很高，其次与ECM-受体相互作用（23.08）， 黏着斑（22.95），补体和凝结级联作用（20.34），氨基糖和核苷酸糖代谢（16.58），氨酰tRNA生物合成（13.95）与糖酵解和肝糖异生（11.49）等。这表明HEPG2来源的外泌体可能参与调节DNA，RNA和蛋白质的合成，加工和降解，以及一些组织相互作用，和糖代谢等。这个结果与生物学过程分析的结果是一致的。

图3 HEPG2来源外泌体的蛋白质KEGG Pathway分析

图4 HEPG2来源外泌体的蛋白质ECM-受体相互作用分析

2.4 HEPG2分泌的外泌体蛋白质ECM-受体相互作用分析

在图3中，我们发现HEPG2外泌体蛋白质中ECM-受体相互作用较为富集。最近有研究报道，外泌体上的整合素和靶细胞的相互作用可以介导外泌体的靶向性，因此分析HEPG2外泌体蛋白ECM-受体相互作用对研究肝癌细胞外泌体的靶向性至关重要。我们通过使用David数据库对信号通路进行分析，我们发现，如图4所示，HEPG2外泌体中包含了多种ECM-受体相互作用的蛋白，可以根据外泌体上整合素的种类，推测外泌体有可能靶向哪些细胞。

近年来，外泌体由于其能够介导细胞、组织之间的相互作用，受到越来越多的关注。外泌体可以携带蛋白质、核酸和脂质等物质，这些“货物”可以被运输到靶组织发挥作用。也可以通过检测蛋白质、核酸等水平的变化来检测疾病的发生。尤其最近研究发现，癌细胞分泌的外泌体表面的蛋白质整合素能够介导外泌体的靶向性，进而促进癌细胞的远端转移，因此研究癌细胞分泌的外泌体的蛋白质组成，对于研究癌细胞与周围组织细胞的相互作用，以及癌细胞的远端转移都具有至关重要的作用。本文主要研究了肝癌细胞的外泌体的蛋白质组成并进一步分析它可能具有的功能。

首先，我们发现肝癌细胞的外泌体蛋白，并不是细胞内蛋白的随即包裹。因为除了膜蛋白和细胞内蛋白等根据外泌体的生成机制推测确实会存在的蛋白以外，外泌体中还含有细胞器蛋白，细胞外区域蛋白等。也就是说外泌体在分泌过程中，并不是细胞本身随机的包裹了一些细胞质内的游离蛋白质，而是一种自主的有序的过程。

其次，我们发现肝癌细胞的外泌体蛋白功能虽然丰富多样，但是相对集中在代谢和相互作用上。代谢方面，26%的蛋白都参与代谢过程，并且这些过程主要集中在糖代谢，核酸代谢，核酸糖代谢上。而相互作用方面则体现在34%蛋白的具有结合活性，4%蛋白在多细胞机体中发挥作用，3%的蛋白参与生物粘附，1%蛋白参与细胞粘结，这些结果都提示了肝癌细胞分泌的外泌体中有较多的蛋白参与细胞之间相互作用。而且信号通路分析也提示了有较多的蛋白参与ECM受体相互作用的通路。

最后，发现了可能的介导肝癌细胞靶向性的分子。由于最新发现整合素介导外泌体与靶组织的靶向性，而肝癌细胞分泌的外泌体中ECM-受体相互作用的蛋白异常富集。可以通过分析能够与肝癌细胞外泌体中的整合素发生相互作用的靶组织来分析肝癌细胞可能的靶向性，这方面还需要更进一步的研究和确认，这将为研究肝癌组织的转移机制以及预测肝癌的远端转移提供新的检测方法。

3 结论

本文研究了肝癌细胞分泌的外泌体的蛋白质的组成，以及其功能进行了全面的分析。这将为研究肝癌细胞通过外泌体跟其他组织细胞相互作用，以及靶向性的研究提供基础。

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Identi fi cation and Characterization of HEPG2 Cell-derived Exosomes by Pro fi ling the Protein Components

Song Huichen, Li Weili, Chu Danping, Li Dameng, Li Jing, Zhang Yujing
(State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology. Collaborative Innovation Center of Chemistry for Life Sciences, Jiangsu Engineering Research Center for MicroRNA Biology and Biotechnology, NJU Advanced Institute for Life Sciences (NAILS), School of life sciences, Nanjing University, 163 Xianlin Road, Nanjing, Jiangsu, 210023, china)

Exosomes were lipid bylayer and ranging from 40 to 130 nm released by a variety of cells. It’s reported that the exosomes bear proteins, lipids, and RNAs, mediating intercellular communication between different cell types in the body, and thus affecting normal and pathological conditions. Recently, it was found that tumor derived exosomes uptaken by organ-specific cells prepare the pre-metastatic niche. Therefore, analysis of protein components of tumor exosomes was very important. In this paper, we were the first to characterize the protein components of liver cancer cell HEPG2 exosomes and this work will be the basis to study the intercellular communication of liver cancer cells with other tissues and the organ-specific metastasis.

exosome; protein; liver cancer; HEPG2 cell

Q291

A

10. 11967/ 2017150106

Q291

ADOI:10. 11967/ 2017150106

高等学校博士学科点专项科研基金资助项（20120091120044）；国家自然科学基金（31200969）

宋蕙晨（1993-），女，硕士研究生，分子生物学

张玉婧（1983-），女，副教授，生物化学与分子生物学。E-mail:yjzhang@nju.edu.cn.