番茄沉默转基因植株的获得及功能初探

刘斯超+许涛+董秀芬+付欣+郑鹏靖+李兵

摘要：Aux/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）作为生长素早期响应因子，其蛋白产物能够特异性地结合生长素响应因子（auxin response factor，ARF），从而调控生长素响应基因的表达，在整个植物生长素信号转导过程中发挥着重要的作用，进而影响植物的生长发育。本研究通过构建沉默载体，在高效遗传转化体系下获得转基因植株，发现利用Gateway克隆技术将番茄生长素早期响应基因 Domain Ⅱ区部分序列连入具有正反2个attr区域并连接1个内含子的pB7GWIWG2（Ⅰ）载体，可在植株体内形成发卡结构导致植物基因沉默，成功构建基因沉默表达载体名为SlIAA RNAi；此外，抗生素喷施和PCR扩增以及实时定量检测进一步鉴定，共获得12棵 RNAi阳性植株。本研究结果将为进一步明确SlIAA的生物学功能和阐明生长素的作用机理提供参考。

关键词：番茄；生长素；；载体构建；基因表达

中图分类号： Q785；Q786文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）05-0029-04

生长素（IAA）在植物的生长和发育中起着重要的作用，它不仅可以作用于细胞膜引起细胞的快速反应，而且还能够在分子水平上特异性地调控基因表达[1-2]。Aux/IAA作为生长素信号反应中的关键调控因子，已经在拟南芥、番茄等模式植物中进行了广泛的研究[3]。Aux/IAA基因属于多基因家族，目前在拟南芥中已发现有29个Aux/IAA家族基因，水稻和玉米中均有31个成员，黄瓜中有28个，棉花上有10个，马铃薯中有27个，苹果中有40个，草莓、高粱和番茄中有26个Aux/IAA家族成员[4-10]。

通过对拟南芥功能获得性突变体的研究，发现多数都是由Aux/IAA蛋白Domain Ⅱ核心区（VGWPP）的某个氨基酸的改变引起的，如Aux/IAA基因的突变会引起生长素反应因子（ARF）功能的紊乱，使植株出现生长素相关的异常表型，对生长素敏感性出现升高或降低

目前有关番茄基因在生長发育中的作用尚无详尽报道。本研究通过转基因手段获得 RNAi植株，在对呈现的表型进行分析的基础上，探讨调控植物生长发育的作用机制，这有利于深化对Aux/IAA功能的认识，进一步了解生长素及其信号转导的分子机制，指导我们在生产实践中利用生长素及转基因技术调节植株生长与发育、果实成熟及产量提升等[9]。

1材料与方法

1.1材料

试验在沈阳农业大学蔬菜实验基地进行，供试番茄品种为中蔬6号，由中国农业科学院提供。供试植物总DNA及RNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自北京天根生化科技有限公司；Prime STAR、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA marker及反转录药品等购自宝生物工程渊有限公司，其他常规药品为国产分析纯。pENTRTM/D-TO[JP2]PO Cloning Kit 和Gateway LR Clonase Enzyme Mix为 Invitrogen 公司产品。以除草剂bar基因为筛选标记的植物表达载体Pb7GWIWG2（I） （ http：//gateway.psb.ugent.be/vector/show/pB7GWIWG2%281%29/search/index/silencing/any）、[JP]大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌LBA4404为笔者所在实验室留存。

1.2方法

1.2.1SlIAA沉默载体的构建

根据已经获得的cDNA全长，按照RNAi原理，设计引物F：5′-CACCGGGAATGAACTGGAATCG-3′，R：5′-CCGCTTTAGAGGCCGTGG-3′。PCR扩增干扰片段并胶回收纯化；TOPO Cloning及热激法转化大肠杆菌；碱裂解法小量提取质粒DNA。

1.2.2番茄植株 RNAi的遗传转化

将构建好的质粒用电击法导入农杆菌LBA4404，用农杆菌介导遗传转化方法转化番茄，待转化植株根系达到5 cm 时，将其移栽盆钵。

1.2.3阳性植株的筛选

通过Blast搜索bar基因序列，设计引物。序列为F：5′-GATAATCATCGCAAGACC-3′；R：5′-TCGACCGTGTACGTCTC-3′。以未转化的中蔬6号植株的基因组DNA作为阴性对照，遗传转化 RNAi载体质粒作为阳性对照，扩增目的片段。PCR扩增程序参照bar基因引物及酶的扩增条件等来设定。

2结果与分析

2.1 RNAi表达载体PCR及酶切检测

将测序成功的克隆重新提取质粒，采用质粒PCR的方法检测终载体，挑去若干个单克隆，同时以空载体质粒作为对照，用特异性引物进行PCR。结果表明pB7G-IAA16表达载体已成功构建，初步验证整合进入目的载体。

对RNAi载体进行限制性内切酶酶切验证SlIAA片段整合的正确性，特别是RNAi载体中的发夹结构。选用了EcoRⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ这3种酶对构建的RNAi载体进行酶切验证，结果发现，用这3种酶切LR反应前的载体pB7GWIWG2分别能切出3 237、3 180、2 167 bp的片段；LR反应之后的载体用Hind Ⅲ酶切可以切出196 bp的片段以及另外2个大小的片段，这3个片段总长为2 148 bp，因为本连入片段分别在第293、488 bp有该酶的酶切位点，XbaⅠ可以切出584 bp长度的片段，而EcoRⅠ酶切位点位于ccdB基因上，因此LR反应后不能切出片段。

2.2电击转化农杆菌检测

将大肠杆菌中提取的 RNAi表达载体质粒电激转化农杆菌LBA4404，利用含有壮观霉素及利福平的YEP固体培养基平板筛选，并挑选单菌落PCR（酶切方法）检测挑选阳性克隆，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3 RNAi植株的遗传转化

本试验所用的植物双元载体pB7GWIWG2（[KG-*5]Ⅰ[KG-*5]）含有bar 基因（图4），所以在整个过程中始终保持0.5 mg/L 草铵膦的抗性筛选，并建立了转基因植株的再生体系，成功地获得了再生植株。

2.4阳性植株的筛选

2.4.1草铵膦（PPT）喷施筛选转基因植株

对无草铵膦抗性的番茄幼苗，进行草铵膦抗性喷施。喷施10 d后发现，当草铵膦浓度为 15 mg/L 时，幼苗生长良好，下部叶片仅出现少量褐斑点；浓度为3 mg/L时，下部叶片出现黄化，仍能正常生长；浓度为 6 mg/L 时，植株叶片黄化，生长势降低（图6-a）。说明筛选转基因苗最佳浓度为6 mg/L。

[JP2]对转基因幼苗进行6 mg/L的草铵膦喷施，4 d后观察发现，不具有草铵膦抗性的转基因植株真叶的叶边缘开始黄化，叶片腐软，随着时间延长，黄化现象开始向整株叶片扩散，生长点灼伤，甚至出现植株死亡；而有草铵膦抗性的植株则无明显变化（图6-b、图6-c）。通过喷施筛选得到33棵抗性植株。[JP]

2.4.2PCR筛选转基因植株

选取已经通过PPT筛选的转基因植株12株，PCR法检测发现条带一致且纯度较高的可以认为DNA无降解，可用于下一步PCR检测。在转基因沉默植株中可以检测到750 bp的PCR产物条带，转化植株的条带与质粒扩增的条带大小一致，大约都为750 bp。

利用RNA提取试剂盒提取总RNA，发现18S、28S条带清晰，可用于cDNA的合成（图8-a）。对目的基因的表达量进行实时定量分析，发现 沉默植株22-01、22-05、22-17、22-03、22-14、22-10、22-07的表达量均显著低于正常植株，分别降低75%、70%、60%、60%、55%、50%、50%（图8-b）。这进一步验证了前面筛选获得的转基因植株是阳性植株，依据数据结果，主要选择22-01转基因株系作为主要研究对象。

2.6组织特异性表达分析

在qRT-PCR分析中，全部以功能葉为对照。在番茄的茎和花中表达较高，分别是对照的3倍和2.5倍，在果实中的表达相对较少（图9-a）。在叶片不同部位的表达。结果显示，在叶基和幼苗中的表达水平显著高于对照，分别是对照的7倍和11倍（图9-b）。在幼叶含量较高，在花蕾中表达水平很高，推测其主要存在于幼嫩部位，对早期发育有重要的调控作用（图9-c）。在果实不同发育时期，其中在绿熟期阶段，表达水平较高，随着果实的不断成熟，其表达水平逐渐降低，推测其

3讨论与结论

将番茄基因Domain Ⅱ区部分序列连入pB7GWIWG（Ⅱ）载体，载体特点为具有2个连续倒置的序列片段并且中间含有内含子，以形成发卡结构导致基因沉默，成功构建沉RNAi表达载体名为SlIAA RNAi表达载体。在构建载体过程中本研究采用的方法是在传统的基础上略加改进的载体构建方式，即利用最新的入门克隆载体，该载体上已经连入attL序列，这样就跳过了BP反应，直接将纯化回收后的PCR产物通过TOPO克隆反应连入入门克隆载体就可以进行LR反应了，与传统BP加LR反应相比更加方便快捷。在选择入门克隆的时候要注意入门克隆载体与目的载体的抗性，二者的抗性要求是不同的，这样在后续筛选阳性克隆时也更加方便，本试验构建的RNAi载体的入门克隆在片段连入时对连入的方向也进行了选择，所以在设计引物时在前引物的5′端增加了CACC 这4个碱基。利用Gateway技术构建的载体是1种二元载体，因此能直接用于农杆菌介导的植物转化，从而为利用RNA干涉技术大规模、高通量的研究植物特异和未知基因功能打开方便之门。

转基因植株的检测作为植物基因工程中的重要一环，越来越成为人们研究的重点。在本试验中，对沉默植株的检测，主要通过外源喷施、PCR检测、RT-PCR检测等方法相互结合，来进一步减少转基因植株的假阳性。虽然，组培筛选及叶片喷施筛选也存在一定的局限性，如叶片喷施草甘膦容易造成植株的大量减产，组培筛选也会因为在时间的把握上存在差别而对草甘膦的反应可能不敏感[15，18]。因此，这就需要在试验中尽量把握好种子萌发过程中草甘膦的浓度及处理时间，重点观察幼嫩叶片对外源喷施筛选的反应情况。

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