SPE－UPLC－MS／MS法测定牛奶中β－内酰胺类药物残留

孙 涛 刘圣红 刘河疆 古丽斯坦 安 静 王 成

（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所／农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）／新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐830091）

仪器应用

SPE－UPLC－MS／MS法测定牛奶中β－内酰胺类药物残留

孙 涛 刘圣红 刘河疆 古丽斯坦 安 静 王 成＊

（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所／农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）／新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐830091）

本试验应用固相萃取技术（SPE），结合超高效液相色谱－串联质谱联用仪（UPLC－MS／MS），建立了快速测定生鲜乳中β－内酰胺类药物残留的方法。样品经乙腈提取，Oaiss PRiME HLB固相萃取小柱净化后，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%水溶液为流动相，Waters C18色谱柱进行分离；多反应监测（MRM）模式，外标法进行定量。方法回收率在70.1%～95.5%之间；相对标准偏差（n＝3）范围为1.0%～9.1%；线性范围为0.002～0.100mg／L；检出限为0.1～0.6μg／kg；定量限为0.3～1.8μg／kg。表明该方法专属性强、灵敏度高，适用于生鲜乳中β－内酰胺类药物残留的测定。

固相萃取 超高效液相色谱－串联质谱 牛奶β－内酰胺类药物

乳制品作为人类膳食结构中动物蛋白质的主要来源之一，对提高生活质量和均衡人类膳食结构具有重要作用。随着人民生活水平的不断提高，乳及乳制品已成为人们生活 中不可缺少的食品之一。牛奶中的抗生素残留，不仅会影响牛奶品质，甚至危害人体健康。我国农业行业标准《无公害食品生鲜牛乳》中明确规定生鲜乳中不得检出抗生素。β－内酰胺类抗生素（β－lactams antbiotics）属于化学结构中含有β－内酰胺环的一类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳氢酶烯类、氧头孢类等［1］。

欧盟、中国、美国等国家及国际食品法典委员会都已对动物源食品中β－内酰胺类抗生素残留量做出了最大残留限量值的规定，用以严格控制β－内酰胺类抗生素在畜牧业中的应用［2］。检测β－内酰胺类抗生素的方法主要有微生物检测法［3］，酶联免疫分析法［4］，液相色谱法（HPLC）［5］，液相色谱－质谱法（HPLC－MS）［68］等。本试验研究了牛奶中β－内酰胺类抗生素前处理方法和UPLC－MS／MS检测条件。结果表明，本方法简便、快速、高效，能提高牛奶中β－内酰胺类抗生素检测的工作效率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XEVO－TQ三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司），配有电喷雾离子源（ESI）；Milli－Q超纯水设备（美国Millipore公司）；漩涡混合器（德国IKA公司）；CT18RT离心机（天美公司）；Oaiss PRiMe HLB小柱（3CC，60mg，美国Waters公司）；微孔滤膜0.20μm（美国Pall公司）。

乙腈、甲醇等均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。水为超纯水。

1.2 标准工作液配制

将阿莫西林（99.0%（纯度，下同））、头孢氨苄（99.0%）、青霉素G钾盐（99.4%）、青霉素V钾盐（99.8%）、苯唑西林（99.0%）、氯唑西林（99.5%）、头孢哌酮（96.5%）、氨苄西林（99.5%）、双氯西林（97.5%）和萘夫西林（91.0%）标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；头孢洛宁、阿洛西林、哌拉西林钠和氟氯西林均为化学对照品，购自中国生物制品检定所。用50%乙腈水溶液配制成质量浓度为100mg／L的标准储备液，依据需要稀释成适当质量浓度的标准工作液，于4℃下保存。

1.3 色谱条件

色谱柱：Acquity C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；柱温：40℃；样品室温度：10℃；进样量：5μL；流动相：溶剂A为0.1%甲酸乙腈溶液，溶剂B为0.1%甲酸水溶液；流速：0.20mL／min；梯度洗脱程序为2min，A5%，B95%；4min，A95%，B5%；5min，A5%，B95%；6min，A5%，B95%。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾正离子源（ESI＋）；毛细管电压：3.00kV；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L／h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：650 L／h。碰撞气：氩气，流量：0.18mL／min，驻留时间100ms，多反应监测扫描模式（MRM）。质谱参数见表1。

1.5 样品采集

由市场、超市购买牛奶样品，混合均匀后，冷藏保存。

1.6 样品处理

准确称取2g（0.001g）混匀后的样品于25mL具塞离心管中，加入5mL乙腈，涡旋混匀1min，10000r／min离心3min，取上清液于10mL玻璃试管，再向25mL具塞离心管中加入3mL乙腈，漩涡混匀后，离心，上清液合并于10mL玻璃试管中，直接过Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，收集滤出液，35℃氮吹至约0.5mL，用水定容至1mL，过0.20μm微孔滤膜，待UPLC－MS／MS分析。

2 结果

2.1 质谱条件的优化

采用蠕动泵自动进样方式，以10μL／min速度将1.0μg／mLβ－内酰胺类抗生素阿莫西林、头孢洛宁、头孢氨苄、氨苄西林、头孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林和萘夫西林标准溶液注入三重四级杆质谱，采用正离子扫描方式进行质谱分析，在选定的ESI（＋）模式下，各组分产生稳定的强峰母离子。再打开碰撞气氩气，通过优化碰撞能量等参数得到相应组分的子离子，扫描出稳定强峰子离子，通过比较响应信号的强弱，选择两组信号较强离子对作为多反应监测子离子。对锥孔电压、碰撞气能量、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化，优化后的质谱条件见1.4。

2.2 色谱条件的选择

β－内酰胺类抗生素残留分析多采用C18柱进行分离，黄百芬等［9］选取ACQUITY BEH C18（100 mm×2.1mm，1.7μm）对19种β－内酰胺类抗生素进行分离，取得较好效果。本试验以ACQUITY BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）作为分析柱，虽然青霉素V（4.51min）、苯唑西林（4.52min）、氯唑西林（4.53min）保留时间有重叠，但由于采用多反应监测（MRM）方式，每种组分各开一时间窗口，因此不影响各组分的定性与定量；运用电喷雾电离源，采用正离子模式电离，加入甲酸可提高待测物质的响应信号；分别采用不同浓度的甲酸水溶液和甲酸乙腈溶液、甲酸甲醇溶液作为流动相进行优化。最终选用的流动相A为0.1%甲酸乙腈溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液。同时选择适当的梯度洗脱程序使14种待测组分得到较好的分离，一次分析仅需6min。总离子流图见图1，图1中1～14号组分依次为阿莫西林、头孢洛宁、头孢氨苄、氨苄西林、头孢哌酮、阿洛西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林和萘夫西林。

表1 多反应监测扫描模式（MRM）的部分质谱参数

图1 14种β－内酰胺类药物总离子流（TIC）图

2.3 前处理条件的选择

生鲜乳品中药物残留提取试剂通常有乙腈、甲醇、丙酮。由于大部分β－内酰胺类抗生素在酸性条件下不稳定，无法采用酸沉淀法来处理牛奶中的蛋白质，黄百芬等［9］通过试验发现采用乙酸铅提取法可以得到较好的沉淀效果和理想的回收率；本试验选取乙腈与奶液体积比为3∶1进行提取，不仅蛋白沉淀效果好，而且提取液中干扰物少。β－内酰胺类药物常用的固相萃取柱有C18柱和HLB柱等［69］，以上两种固相萃取小柱用前均需活化，上样后均需淋洗和洗脱的步骤；本试验应用Oaiss PRiMe HLB固相萃取柱，无需活化、淋洗和洗脱的步骤，采取直接过滤净化的方式，提高了样品前处理的速度。

2.4 线性关系、方法准确度及精密度、检出限及定量限

2.4.1 线性关系

选取空白样本提取液配制系列基质标准工作溶液，绘制标准曲线进行定量，线性关系和相关系数见表2。在0.002～0.100mg／L范围内，14种β－内酰胺类药物线性相关系数r≥0.9968。

表2 β－内酰胺类药物线性范围、线性关系和相关系数

2.4.2 方法准确度及精密度、检出限及定量限

对β－内酰胺类药物分别按0.002、0.010、0.050mg／kg添加水平对生鲜乳进行了加标回收试验，得到了较好的结果，回收率及其相对标准偏差RSD（n＝3）见表3。在3个添加水平，平均回收率在70.1%～95.5%，RSD≤9.1%；以添加标准样品0.002mg／kg时按3倍信噪比计算方法检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ）。

表3 β－内酰胺类药物添加回收率、LOD与LOQ

续表3

3 结论

试验选取生鲜乳作为测试样品，SPE法净化结合液相色谱串联质谱法；采用电喷雾离子源（ESI＋），Acquity C18超高效液相色谱柱对生鲜乳中β－内酰胺类药物进行分离；建立了超高效液相色谱－串联质谱法测定生鲜乳中β－内酰胺类药物残留的分析方法，该方法简便、快速、灵敏，测定结果满足生鲜乳中β－内酰胺类药物残留的检测要求。

［1］白国涛，储晓刚，潘国清，等.β－内酰胺类抗生素残留检测技术研究进展.食品科学，2008，2（7）：485－489.

［2］袁萍，刘亚风，祝伟霞，等 .动物源性食品中β－内酰胺类药物残留检测研究进展.检验检疫学刊，2010，20（3）：65－68.

［3］李延华，王伟君，张兰威，等 .微生物法检测牛乳中β－内酰胺类抗生素残留的对比研究 .中国抗生素杂志，2009，34（1）：63－66.

［4］姜侃，陈宇鹏，金燕飞，等 .应用酶联免疫法快速检测乳品中β－内酰胺类抗生素残留 .中国乳品工业，2010，38（1）：51－54.

［5］孙艳侠 .高效液相色谱在乳品抗生素残留检测中的应用.山西农业科学，2010，38（3）：10－13.

［6］孙雷，张骊，汪霞，等 .超高效液相色谱－串联质谱法对动物源性食品中13种β－内酰胺类药物残 留的检测 .分析测试学报，2009，28（5）：576－578.

［7］宋志超 .动物源食品中β－内酰胺类抗生素残留的超高效液相色谱－串联质谱分析方法研究.郑州：郑州大学，2009.

［8］贾涛 .液相色谱－串联质谱法检测牛奶中β－内酰胺类药物残留的研究.中国乳业，2014，156（12）：53－57.

［9］黄百芬，吴丹青，蔡增轩，等 .超高效液相色谱－串联质谱法同时测定牛奶中19种β－内酰胺类抗生素 .中国卫生检验杂志，2010，20（1）：1－6.

Determination ofβ－lactams residues in milk by SPE－UPLC－MS／MS.

Sun Tao，Liu Shenghong，Liu He－ jiang，Gulisitan，An Jing，Wang Cheng＊
（Institute of Quality Standards ＆Testing Technology for Agro－Products，XinJiang Academy of Agricultural Science，Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro－Products（Urumqi），Key Laboratory of Agro－Products Quality and Safety of Xinjiang，Urumqi 830091，China）

The samples were extracted by acetonitrile and purified with Oaiss an PRiME HLB cartridge.The UPLC analyses were performed on an Acquity UPLC C18column with gradient elution using acetonitrile（containing 0.1%formic）and water（containing 0.1%formic）as mobile phase.The mass spectrometric acquisitions were carried out by means of multiple reaction monitoring（MRM）in electrospray positive ionization mode.The average recoveries ofβ－lactams antibiotics ranged from 70.1%to 95.5%，with the relative standard deviation from 1.0%to 9.1%，the calibration curve was liner from 0.002to 0.100mg／L，the detection limits ofβ－lactams antibiotics were 0.1－0.6μg／kg and the limit of quantitation were 0.3－1.8μg／kg.This method is specific，sensitive and suitable for determination ofβ－lactams antibiotics in the milk.

SPE；UPLC－MS／MS；Milk；β－lactams antibiotics

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.002

2016－06－27

自治区公益性科研院所基本科研项目（KYGY2016094）；2016年生鲜乳农兽药、重金属和生物毒素等危害因子摸底排查与验证评估项目（GJFP201600802）

孙涛，男，1978年出生，高级实验师；E－mail：suntaotxy＠126.com。

王成，男，1971年出生，研究员，主要从事农产品质量安全工作。