社区儿童沙眼衣原体、解脲脲原体检测分析

吴永平

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、慢性粒细胞白血病（CML）以及原发性骨髓纤维化（PMF）、慢性中性粒细胞白血病（CNL）、肥大细胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒细胞白血病（CEL）和不能分类的MPNs。

JAK2介导包括红细胞生成素（EPO ）、血小板生成素（TPO ）、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF ）、生长因子（GH） 、白细胞介素3 （ IL-3 ）在内的多种细胞因子的信号转导，并通过JAK2-STAT途径促进或者调节细胞的增殖。研究发现JAK2V617F突变在多种恶性血液病中都有发现，本课题通过合成的JAK2V617F特异性引物，用PCR以及基因测序等方法检测其突变，对进一步阐明其引发的广谱的血液病提供临床诊断及治疗依据。

1 方法：

1.1 病例收集：收集我院住院确诊的相关患者，共46例。其中PV组8例；ET组12例；CML组4例；PMF组2例；CNL组6例；CEL组2例；嗜碱性粒细胞增多症（basophilia）组1例；AML组3例；ALL组8例；10例健康志愿者对照。各型白血病诊断标准均参照WHO制定的最新相关标准，其中PV，ET和PMF诊断标准[1]

1.2 仪器与试剂：定性PCR扩增仪：美国Bio-Rad公司Thermal Cycler C1000型。电泳仪：美国Bio-Rad公司 Basic型。凝胶成像分析系统：美国UVP公司EC3 Chemi HR 410 Imaging System。测序仪：美国ABI公司3500。DNA Marker、2×Taq PCR MarkerMix、血液基因组提取试剂盒购自南京凯杰基因。

1.3 引物序列如下，上海invitrogen合成：

F1：5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′；

F2：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′；

R：5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。

1.4 抽取患者和正常对照外周血（骨髓）2mL，提取基因组DNA，采用等位基因特异性PCR（AS-PCR），取5μLPCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳后用美国UVP公司EC3凝胶成像分析系统分析图像、摄像并保存结果。

2 结果

2.1 阴性、阳性的判断

JAK2V617F基因突变PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果出现364bp和243bp2条条带者为阳性，出现364bp一条条带者为阴性。如图3。

2.2 PV组阳性率为87.5%（7/8），ET组阳性率为33.3%（4/12），PMF组阳性率为50%（1/2） ，AML、ALL、CML、CNL、CEL等恶性血液病患者及正常对照均为阴性。

2.3 JAK2V617F基因突变在PV、ET、PMF患者中的阳性率有显著性差异（X2=6.239，P值=0.044 <0.05）。

3 讨论

James等[1]首先报道了在PV患者中发现JAK2V617F点突变，而其后在其他MPNs亚型中也相继发现了该基因突变的存在，但其阳性率高低不一。

本实验研究亦发现，JAK2V617F点突变在PV疾病中阳性率最高，而后是PMF、ET疾病，而在CML、AML、ALL疾病中为阴性，与国际上的报道相符[2]。本实验中ET患者中JAK2V617F的基因突变与血红蛋白含量、血小板数量无关，但国外有报道ET患者中JAK2V617F点突变阳性者血红蛋白量较高、血小板计数较低，故本实验还有待增加病例总数以便作进一步分析。PV患者阴性例数较少，故未做比较。PV以及ET阳性患者的白细胞计数高于阴性患者，国外研究亦发现阳性患者中白细胞计数高，且可以作为独立的危险因素与血栓形成及骨髓纤维化成正相关。

参考文献

[1]James C，U go V，Couedic JPL，et al.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature，2005，434（7037）：1144～1148.

[2]Kannim S，Thongnoppakhun W，Auewarakul CU.Two-round allele specific-polymerase chain reaction：a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J].Clin Chim Acta，2009，401（1～2）：148～151.