低分子肝素制备方法研究进展

李美花

摘 要：低分子肝素由于吸收性好、安全性及生物利用率高等优点，而逐渐取代肝素应用于临床。文章介绍了低分子肝素的基本概念，简述了其发展过程，重点综述了制备低分子肝素的化学降解法和酶解法，探讨了其发展趋势，为相关研究者提供参考。

关键词：低分子肝素；LMWH；降解

低分子肝素（LMWH）是在普通肝素的基础上发展的新一代肝素类抗凝血药物，是使用合适方法将肝素分级或降解得到的具有较低分子量的肝素组分或片段。20世纪70年代中，在肝素研究史上取得了两大突破：一是发现肝素中仅有30%～50%的组分可以结合ATⅢ发挥抗凝血活性，这改变了“肝素的每一个分子都有抗凝血活性”的老观点；二是发现以往认为并无无活性的低分子肝素对Ⅱa因子有强的抑制作用[1]。20世纪70年代末，低分子肝素进入临床使用。

低分子肝素的制备方法主要有物理制备法、化学降解法、酶解法和合成法。不同的制备方法可获得不同分子量和生物活性的 LMWH，彼此不能代替使用。以下主要对化学降解法和酶解法进行综述。

1 化学降解法

化学法是指利用化学反应获取低分子量肝素的方法，使肝素糖环或糖苷键断裂，从而，大分子的肝素降解成低分子量的肝素及相应寡糖，主要的方法有亚硝酸降解、β-消除降解法、过氧化氧降解法、光化学降解法。

1.1 亚硝酸降解法

这是最经常使用的一种方法。酸性条件下，肝素中游离的氨基与亚硝酸发生重氮化反应，断裂在氨基葡萄糖的残基部位，最终生成低分子量肝素和氮气。此反应条件较温和，并且这种方法在低分子肝素的末端引入了新的缩环的甘露糖残基的还原基团。然而，亚硝酸降解法对N硫酸化的氨基葡萄糖残基的保护作用不完全，又偏偏这些残基是抗凝血酶III结合所必需的片段。反应过程中，通过控制亚硝酸的量，酸碱度，反应温度和时间等，可控制生成的产物的分子量[2]。

1.2 β-消除降解法

β-消除降解法包括肝素季铵化、酯化和降解三个步骤[3]。在碱性条件下，肝素会发生β-消除反应，断裂在艾杜糖醛酸残基部位，从而生成低分子量肝素，但会引起多糖链结构的变化和多糖基上O-硫酸基团脱落，会丧失原有部分功能。酯化肝素中的糖醛酸可以增强α-H的酸度，非水相或水相介质条件下，肝素酯更容易与亲和基团发生β-消除反应。肝素的卤代苄基化合物和季铵盐在DMF或二氯甲烷中能够发生酯化反应，生成的酯在碱性条件下可以水解成LMWH。控制季铵盐的种类碱性条件、季铵盐的用量可以控制肝素的降解程度，从而获得不同分子量分布的产物。

1.3 过氧化氢法降解法

过氧化物由于拥有不配对电子的氧自由基，因此化学反应性极高。该法关键是利用过氧化氢在铜离子催化下分解生成羟基自由基，在所生成的自由基攻击下，糖链发生断裂[4]。制备过程中，条件较温和，温度和pH均没有显著变化，肝素的活性中心不易被破坏，但是硫酸化程度较高，过程中铜离子等杂质的引入为后期的处理造成了困难。过氧化氢法也适用于其他糖胺聚糖的解聚，如刺参糖胺聚糖、硫酸皮肤素和硫酸软骨素等。

1.4 光化学降解法

电喷雾傅立叶变换质谱和氢谱测试证明，光化学降解肝素是一个随机的、可发生在Heparosan多糖中的N-乙酰胺残基或葡糖醛酸的过程。Higashi等[5]利用TiO2催化下的光化学反应，将E. coli K5发酵生产的分子量大于15000 Heparosan成功降解至8000左右，解聚前后结构没有发生变化的过程。进一步地，Higashi等[6]还成功使用过滤器-硼硅玻璃灯降解硫酸化多糖-肝素并显著减少硫酸化基团的脱去。

2 酶解法

通过控制肝素酶的用量和种类、降解时间等一系列条件可得到不同分子量分布范围的低分子肝素。酶解法选择性较强，肝素降解后在末端产生在232nm处有特异的光吸收的不饱和的糖醛酸，该光吸收特征可以作为检测信号；Heparnase-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是目前常用的三种肝素酶[7]。这三种酶的基因序列不同，降解肝素的位点也有所差异。使用多种肝素酶降解肝素或类肝素，可生成肝素寡糖或二糖等小片段，这有利于对肝素结构的分析。

3 总结与展望

酶解法反应条件温和、选择性高，但是成本较其他方法高，大规模工业生产还有待实现；光化学降解法能降低反应过程中硫酸基团的丢失，保持样品的内部结构，从而更好的保持肝素的抗凝血活性。其他化学降解法容易由于硫酸基团丢失而影响产物的抗凝血活性。除了抗凝活性，LMWH的抗炎作用临床使用并不成熟；此外，其还有调节细胞增殖、抗肿瘤、预防腹部术后粘连等作用[8]，但均有待成熟。未来对于LMWH抗凝以外的生物活性及其临床应用是研究工作的主要方向。

参考文献

[1]张利 .低分子量肝素药物的质量标准综述[J].科技传播，2010，8（下）：91-92.

[2]张丽萍，李雷刚，马中苏.亚硝酸降解法制备低分子肝素的工艺参数优化与确定[J].药物分析杂志，2009（7）：1148-1152.

[3]王 .一种超低分子肝素钢的制备方法及其应用[P].中国专利：102952202，20130306.

[4]Robert J L， Pdnsg M S. Production and processing of low molecular weight heparins[J]. Semin Thmmb Hemost， 1999，25（3）：5-16.

[5]Higashi K，Ly M，Wang Z Y，et al. Controlled photochemical depolymerization of K5 heparosan，a bioengineered heparin precursor[J].Carbohydr Polym，2011，86（3）：1365-1370.

[6]Higashi K，Hosoyama S，Ohno A，et al. Photochemical preparation of a novel low molecular weight heparin[J]. Carbohydr Polym，2012，87（2）：1737-1743.

[7]Linhardt R J. Analysis of glycosaminoglycans with polysaccharidelyases[J]. Curr Protocols Mol Biol，1999，17（13B）：11-17.

[8]劉利.系列肝素药物质量分析及控制研究[D].江苏：苏州大学，2014：1-48.