HDL对HepG2细胞糖原合成的影响及机制研究

付 虹，戎有和

HDL对HepG2细胞糖原合成的影响及机制研究

付 虹1，戎有和2*

目的 探讨HDL对HepG2细胞糖原合成的影响及其机制。方法 采用肝糖原/肌糖原试剂盒测定HDL对糖原合成的影响，并用Western blot实验探讨其机制。结果 HDL可以促进HepG2细胞对糖原的合成。此过程中发生了PI3K-AKT-GSK-3蛋白通路的磷酸化。结论 HDL促进HepG2细胞糖原的合成有胰岛素信号途径及其下游PI3K/AKT-GSK-3的参与。

高密度脂蛋白；HepG2细胞；糖原合成；胰岛素抵抗

0 引言

胰岛素抵抗是外周组织对胰岛素反应性下降的一种病理生理状态，是糖尿病、血脂异常和肥胖症等代谢性疾病共同的生理病理基础[1-2]。肝脏的胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的主要原因，在HepG2细胞中，表达很多胰岛素信号途径和葡萄糖代谢过程中的基因。因此，在分析葡萄糖、脂质代谢和肝脏胰岛素抵抗的研究中，HepG2细胞是一个很适用的工具细胞[3]。因此，本文采用HepG2细胞作为工具细胞，研究外源性给予HDL对其糖原合成的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2细胞购自上海中科院研究所细胞库。

1.2 试剂和药品 肝糖原/肌糖原测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司；MEM-α培养基购自Gibco公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自美国Clark公司；单克隆GSK-3抗体、单克隆PI3K(P85)抗体、AKT抗体、磷酸化的单克隆GSK-3抗体、PI3K(P85)抗体、AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；ECL发光液试剂购自北京普利莱公司；单克隆β-actin抗体购自武汉博士德公司；辣根过氧化物酶标记的二抗来自Bioward公司；PVDF膜(0.2 μm)购自美国Millipore公司；其他常用试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 生物分光光度计：德国Eppendorf公司产品；水平电泳仪、电泳槽、垂直电泳仪、电泳槽：美国Bio-Rad公司产品；JS-380C全自动数码凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司产品；Biofuge fresco低温离心机：德国Heraeus公司产品；WH-2微型旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂产品；EC-5型恒温水浴仪：德国Julabo公司产品。

2 方法

2.1 HepG2细胞的培养和传代 HepG2细胞呈聚集型生长，培养基为MEM-α (含10%的胎牛血清，1%链霉素-青霉素的双抗)置37 ℃、5% CO2培养箱培养。每2天更换培养基1次，至细胞单层融合达80%以上时，可进行传代培养。用EDTA-胰蛋白酶1 mL消化细胞1 min，待细胞变圆并从瓶壁上脱落，立即加入含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。调节细胞浓度为(2～3)×105个/mL，接种于10 cm的塑料培养皿中或六孔板中。

2.2 实验分组 采用传代10代以内的分化后的HepG2细胞，分为4组：正常组(Normal组)、高密度脂蛋白组(HDL组)、胰岛素组(Insulin组)、高密度脂蛋白+胰岛素组(HDL+Insulin组)。

2.3 给药 生长状态良好的HepG2细胞给予无血清MEM培养24 h，在培养基中加入30 nM葡萄糖，之后分组给药，收集细胞。

2.4 肝细胞内糖原含量的测定 严格按照肝糖原/肌糖原试剂盒的说明，对HepG2细胞中的糖原含量进行测定。

2.5 Western blot 各组分别给药10 min后，用胰酶消化细胞，收集，用RIPA裂解细胞，提取细胞的总蛋白并测定其各组浓度。之后按以下步骤检测p-AKT、p-P85、p-GSK-3β、p-GSK-3α蛋白的表达。

①灌胶、上样：其中分离胶10%，浓缩胶5%。②SDS-PAGE电泳：先恒压85 V、20 min，待样品全部进入分离胶后，改为恒压110 V、2 h。③转膜：PVDF 膜，转膜条件为4 ℃，恒压110 V、2 h。④封闭：用5%脱脂奶粉封闭液，室温封闭2 h。封闭液用TBST (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween 20)配制。⑤一抗结合：TBST稀释一抗(p-P85抗体滴度为1∶1 000；p-AKT抗体滴度为1∶1 000；p-GSK-3β抗体滴度为1∶1 000；p-GSK-3α抗体滴度为1∶1 000；β-actin抗体滴度为1∶200)，4 ℃过夜。⑥洗膜：TBST漂洗3次，5 min/次。⑦二抗结合：TBST稀释二抗，室温孵育2 h。⑧洗膜：TBST漂洗4次，10 min/次。⑨显色：使用化学发光显色试剂进行显色，用成像系统仪器观察拍照。

3 结果

3.1 HDL处理后不同时间段HepG2细胞内的糖原含量 分组后的细胞给予HDL 100 μg/mL后，在不同的时间段终止孵育，收集细胞，测定细胞内糖原含量的变化。研究显示，给予HDL后1.5 h，HepG2细胞内糖原含量明显增加。见图1。分别在给予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nM后30 min、1.5 h、3 h收集细胞，测定细胞内糖原的含量对HepG2细胞内糖原含量的影响。结果显示，给予HDL 100 μg/mL和Insulin 100 nmol/L促进糖原合成的能力相当，结果见图2。

图1 不同时间点HepG2细胞内糖原含量/蛋白比(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

图2 各组糖原含量/蛋白比(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

3.2 HDL对HepG2细胞内的PI3K途径中信号蛋白的影响 与Normal组相比，外源性给予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nmol/L组PI3K(P85)蛋白和AKT蛋白磷酸化明显增强。与Normal组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4。

图3 四组AKT的磷酸化图(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

3.3 HDL对HepG2细胞内糖原合成相关蛋白(GSK-3)的影响 外源性给予HDL 100 μg/mL、Insulin 100 nM、HDL 100 μg/mL+Insulin 100 nmol/L组与Normal组相比，GSK-3β蛋白和GSK-3α蛋白磷酸化明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、图6。

图4 四组PI3K(P85)的磷酸化图(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

图5 四组GSK-3β的磷酸化图(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

图6 四组GSK-3α的磷酸化图(n>3) 注：#与Normal组比较，P<0.05

4 讨论

本次试验采用HepG2细胞作为工具细胞，研究外源性给予HDL后对糖原合成的影响。Insulin可以激活糖原合酶促进糖原合成，因此，本研究应用Insulin作为阳性对照组。前期试验已经证实，Insulin的最佳给药浓度为100 μg/mL，与文献报道一致[4]。首先，我们将HepG2细胞在不同的时间段终止孵育，收集细胞，测定细胞内糖原含量的变化。研究显示，给予HDL后1.5 h，HepG2细胞内糖原含量明显增加。随后，分组实验显示，给予HDL组、Insulin组、HDL+Insulin组的糖原合成量均明显高于空白组，且差异有统计学意义。

胰岛素介导的糖原合成途径包括PI3K及其下游的AKT[5-7]。胰岛素与胰岛素受体结合，激活胰岛素受体底物-1(IRS-1)，随后激活下游的PI3K、AKT、PDK-1等分子[8-11]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇肌酶，本身具有丝氨酸/苏氨酸肌酶的活性，由调节亚基P85和催化亚基P110构成。给予PI3K的抑制剂(LY294002或者wortmannin)可以阻止胰岛素诱导的糖原合酶的活性增加[12-13]。AKT 是胰岛素刺激糖原合成途径中GSK-3的上游调节元件[14-16]。AKT激活后，可以使GSK-3α第21位的丝氨酸(Ser21)和GSK-3β第9位的丝氨酸(Ser9)位点磷酸化并失活，从而阻止GSK-3对糖原合酶的磷酸化，促进糖原的合成[17-18]。有研究证实，在HepG2细胞和骨骼肌细胞中，给予胰岛素刺激后，糖原合酶活性增加也是通过PI3K途径及其下游的AKT和GSK-3蛋白实现的[19-20]。本实验结果显示，在外源性给予HDL后，PI3K和AKT蛋白都出现了明显的磷酸化表现，与Normal组相比差异有统计学意义。说明HDL促进HepG2细胞内糖原合成是有胰岛素信号途径参与的。

GSK-3是糖原合酶的一个负性调控因子[21]，是一种调节糖原代谢的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶，其在糖原合酶的失活过程中起重要作用[22]。目前，大量资料已经对GSK-3在葡萄糖稳态中的作用进行了广泛研究。在静息状态下，GSK-3一直处于有活性状态[23]，GSK-3磷酸化状态是没有活性的，处于活性状态的GSK-3可以使糖原合酶的活性降低，失活，从而使糖原合成减少[24-26]。有报道，在L6肌肉细胞和小鼠离体骨骼肌细胞中，过量表达GSK-3或者是丝氨酸9位点变异的GSK-3，会抑制胰岛素诱导的糖原合酶的活性[27-28]。研究显示，在给予HDL后，GSK-3α和GSK-3β蛋白也出现了明显的磷酸化表现，与Normal组相比差异有统计学意义。因此，我们认为，HDL促进糖原合成有胰岛素信号途径及其下游PI3K/AKT-GSK-3的参与。最近研究发现，AMPK在肝糖代谢的过程中也起着重要的作用，在胰岛素抵抗相关的2型糖尿病的过程中可以发现AMPK信号途径的缺陷[29-31]。因此，需要进一步探索该过程的作用机制，以阐明这一现象。

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Effect of HDL on glycogen synthesis in HepG2 cells and its mechanism

FU Hong1,RONG You-he2*

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of HDL on glycogen synthesis in HepG2 cells.Methods The effect of HDL on glycogen synthesis was studied by liver glycogen/muscle glycogen Kit,and the mechanism of the effect was explored by Western blotting experiment.Results HDL could promote the glycogen synthesis in HepG2 cells;meanwhile,the phosphorylations of PI3K-AKT-GSK-3 proteins appeared.Conclusion HDL stim ulates glycogen synthesis in HepG2 cells,which involves the insulin signaling pathway and its downstream PI3K-AKT- GSK-3 signaling pathways.

HDL;HepG2 cell;Glycogen synthesis;Insulin resistance

2016-09-08

1.南京中医药大学附属医院，南京 210029；2.南京中医药大学，南京 210029

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704005