亚硝酸盐对植物乳杆菌FQR细胞表面性质及形态的影响

韦田，梅林，王志耕，薛秀恒

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽农产品加工工程实验室，安徽 合肥，230036)

亚硝酸盐对植物乳杆菌FQR细胞表面性质及形态的影响

韦田，梅林，王志耕，薛秀恒

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽农产品加工工程实验室，安徽 合肥，230036)

研究不同NaNO2浓度对植物乳杆菌(Lp)FQR降解NaNO2能力、亚硝酸盐还原酶(NiR)活性以及细胞表面特性的影响，并经电镜观察细胞形态。结果表明，在0～0.150% NaNO2范围内，随着浓度的增大，FQR降解能力以及NiR活性均呈下降趋势，在0.045% NaNO2条件下，FQR能够高效降解NaNO2，16 h降解率达(94.85±2.96)%，NiR活力(174.60±13.67)U/104细胞，而高浓度NaNO2会引起细胞表面疏水性和膜通透性发生显著升高。扫描电镜观察发现，0.045% NaNO2条件下FQR表面形态与对照组相比未发现明显变化，但0.120% NaNO2时菌体表面出现褶皱和凹陷。透射电镜观察发现，对照组中FQR存在大量储能颗粒，随着NaNO2浓度增大，颗粒物数量明显下降；在0.120% NaNO2时胞内储能物质几乎消失，并出现细胞质空化现象。高浓度NaNO2会引起菌体表面形态和内部结构发生明显变化。

亚硝酸盐；植物乳杆菌；亚硝酸盐还原酶；细胞表面性质；电镜

亚硝酸盐是一种重要的食品添加剂，常用于肉制品加工。中国传统腌肉制品添加亚硝酸盐已有上千年历史，亚硝酸盐在其中具有发色、抑菌、抗氧化和形成独特风味等重要作用[1]。由于亚硝酸盐的残留和积累具有潜在的食品安全风险，其应用受到很大限制。虽然有部分添加物可以在一定程度上替代亚硝酸盐[2-3]，但是还没有哪一种物质能够完全彻底地替代亚硝酸盐在肉类食品中的作用。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，Lp)与人类的生活密切相关，是发酵食品中常用发酵剂，还具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养吸收等多种功能。有文献报道[4-5]，Lp菌具有降解亚硝酸盐的能力，在泡菜发酵过程中产生亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，NiR)，降解亚硝酸盐[6]。王盼等[7]利用PCR技术克隆Lp NiR基因编码序列，将其构建至原核表达载体，经诱导表达及表达产物的纯化，最终获得高纯度的NiR。但是，对于Lp调控亚硝酸盐代谢的机制还不清楚。

本课题研究了在不同浓度的亚硝酸盐环境下，Lp对亚硝酸盐的降解效果及其自身的细胞学特性，旨在为探明Lp对亚硝酸盐的应答调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基

植物乳杆菌FQR(Lp FQR)从中国传统腌肉制品中筛选得到，由安徽农业大学畜产品加工实验室提供。

MRS肉汤培养基：蛋白胨 10 g，牛肉粉5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钠5 g，MgSO40. 2 g，MnSO40. 05 g，吐温80 1.0 mL，加入1 000 mL蒸馏水，制得pH(6. 2±0.1)肉汤培养基。

MRS固体培养基：上述MRS肉汤培养基中添加15 g琼脂。

亚硝酸钠盐培养基：MRS肉汤培养基中添加一定量的NaNO2(m∶m)。

1.1.2 试剂

NaNO2、K2HPO4、KH2PO4、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、二甲苯等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Fluo3-AM 荧光探针，上海碧云天生物技术有限公司；亚硝酸还原酶试剂盒，苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 主要仪器及设备

LS-45荧光分光光度计、Lambda 35紫外可见分光光度计，珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司；JY92-IIN超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；JSM-7500F扫描式电镜、JEM-1230透射式电镜，日本电子株式会社；超薄切片机，(瑞典)LKB产品有限公司；FA2004 电子分析天平，上海上天精密仪器有限公司。

1.3 实验验方法

1.3.1 亚硝酸盐含量的检测

参照GB/T5009.33—2010 《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[9]，并结合张馨月等[10]测定方法，略有修改。培养基置于离心管中3 500×g离心5 min，取上清液，不经过提取液净化的步骤，直接加2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min 后各加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液(2 g/L)，静置15 min，于波长538 nm处测定吸光度值。同时做试剂空白。NaNO2含量计算公式如下：

式中：X—试样中NaNO2的含量，mg/kg；A1为测定用样液中NaNO2的质量，μg；m为试样质量，g；V1为测定用样液体积，mL；V0为试样处理液总体积，mL。

1.3.2 Lp亚硝酸盐降解能力的检测

将冻存的Lp FQR接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，活化菌种。取100 μL菌液涂布于MRS固体培养基上，37 ℃培养36 h，挑取单菌落于30 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃培养至稳定期(16 h)，作为Lp FQR种子液。下面试验接种量均以种子液添加。

以2 %接种量接入含有0～0.150 % NaNO2MRS肉汤培养基中，37℃培养稳定期(16 h)。按照1.3.1 的方法测定培养基中NaNO2含量，每组3个重复。NaNO2降解率(degradation rate，DR)公式如下：

DR/%= (1-X2/X1)×100

式中：X1为原始培养基中NaNO2的含量mg/kg；X2为培养16 h后培养基中NaNO2的含量，mg/kg。

1.3.3 NiR活性测定

以2%接种量接入含有0～0.150% NaNO2MRS肉汤培养基中，37 ℃培养16 h。培养液于4℃下3 500×g离心10 min，弃上清，收集菌体，用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)洗涤2次后重悬于PBS，置于冰上超声波破碎细胞，超声波细胞破碎仪工作参数为：功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时长3 min。破碎细胞液于4 ℃下10 000×g离心10 min，取上清液置于冰上，利用亚硝酸还原酶试剂盒测定酶活。酶活单位定义为：每104个细胞每小时还原1 μmol NO2-的量为1个酶活单位。

1.3.4 细胞表面疏水性试验

本试验采用微生物黏着碳烃化合物法[11]，以2 %接种量接入含有0～0.150 % NaNO2MRS肉汤培养基中，37 ℃下培养16 h，菌液在3 500×g离心 10 min，弃上清，收集菌体。用0.02 mol/L PBS(pH7.2)洗涤2次，重悬于灭菌的 0.1 mol/L KNO3溶液中，使菌悬液600 nm处吸光度值达到(0.5±0.02)(A0)。取 3 mL菌悬液与 1 mL二甲苯混匀后在室温静置 10 min，涡旋振荡2 min 后再静置10 min，吸取水相于600 nm处测定吸光度(A1)。细胞表面疏水性(cell surface hydrophobicity，CSH)公式为：

1.3.5 细胞膜通透性试验

本试验利用细胞内Ca2+测定采用Fluo3-AM 荧光探针法[12]评价细胞膜通透性。以2 %接种量接入含有0～0.150% NaNO2MRS肉汤培养基中，37℃下培养16 h，菌液在3 500×g离心10 min，弃上清，生理盐水洗涤并稀释至一定浓度的菌悬液(1.0×108CFU/mL)。取3mL 菌悬液，加入0.6 μL 5 mmol/L Fluo3-AM溶液，37 ℃避光孵育30 min，10 000×g离心5 min，弃上清液，用生理盐水洗涤1次后，重悬于3 mL生理盐水中。将负载好的样品置于荧光分光光度计内，以488 nm为激发波长，观察525 nm处的荧光强度。

1.3.6 扫描式电镜观察

以2%接种量接入分别含有0、0.045%和0.120% NaNO2MRS中，37 ℃下培养16 h后，4℃ 3 500×g离心10 min，弃上清液，加入浓度2.5%戊二醛PBS缓冲溶液，4 ℃冰箱内固定12 h后，0.1 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤3次，再经30%、50%、70%、80%、95%及100%乙醇依次脱水，CO2临界点干燥，喷金，扫描式电镜观察并拍照。

1.3.7 透射式电镜观察

以2 %接种量接入分别含有0、0.045% 和0.120% NaNO2MRS中，37 ℃下培养16 h后，4 ℃ 3 500×g离心10 min，弃上清液，加入浓度2.5%戊二醛PBS缓冲溶液，4℃冰箱内固定12 h后，0.1 mol/L PBS缓冲液(pH7.2)洗涤3次，用1 %锇酸固定2 h，再用0.1 mol/L PBS缓冲液漂洗数次。依次30%、50%、70%、90%及100%乙醇梯度洗脱，用环氧丙烷和环氧树脂按1∶1(v∶v)浸透2 h，再于环氧丙烷和环氧树脂按1∶2(v∶v)浸透1 h，环氧树脂固化过夜，烤箱内加温成块，经超薄切片染色，透射式电镜观察并拍照。

1.4 统计分析

采用SPSS 18.0对实验结果进行差异显著性分析，结果以平均值±标准差表示，P<0.05 为差异显著，用Origin 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 Lp FQR降解NaNO2能力

在0.045%～0.225% NaNO2范围内，随着MRS肉汤培养基中NaNO2含量的增加，FQR降解NaNO2能力呈下降趋势(图1)。但FQR于0.045 %和0.075 % NaNO2MRS中DR无显著差异(P>0.05)，分别为(94.85%±2.96%)和(94.18%±3.87%)，说明在0～0.075% NaNO2范围内，FQR具有良好的降解NaNO2能力；0.120% NaNO2条件下，FQR降解能力显著降低(P<0.05)，DR为(50.49%±4.54%)。而在0.225% NaNO2浓度时，DR仅为(7.05%±2.77%)，同时，取100 μL菌液涂布于MRS固体培养基上，结果发现无活菌存在，而部分NaNO2的降解可能是由于菌体前期适应过程产生。因此，高浓度的NaNO2对Lp降解NaNO2能力具有抑制作用。

图1 不同浓度NaNO2对FQR降解能力的影响Fig.1 Effect of different concentrations of NaNO2on degradation ability of FQR

2.2 不同浓度NaNO2对Lp FQR亚硝酸盐还原酶活性的影响

目前，普遍认为微生物主要利用NiR降解NaNO2。本研究中Lp FQR在0～0.150% NaNO2范围内，NiR活性呈下降趋势，与图1结果基本相符合，但0.075% NaNO2时NiR活力为(119.68±9.03) U/104细胞，相对于0.045% NaNO2条件酶活力下降了31.45%(P<0.05)(图2)。Lp FQR于空白和0.045% NaNO2MRS中NiR活力差异不显著(P>0.05)，分别为(181.55±8.63) U/104细胞和(174.60±13.67) U/104细胞，说明0～0.045% NaNO2浓度范围内，NiR活力没有受到显著影响。但超过此范围NiR活性受到明显的抑制，并且NaNO2浓度越大，抑制作用越强，0.150 % NaNO2浓度时，NiR酶活仅为(29.23±5.81)U/104细胞。

图2 不同浓度NaNO2对FQR亚硝酸盐还原酶活性的影响Fig.2 Effect of different concentrations of NaNO2 on nitrite reductase activity of FQR

2.3 不同浓度NaNO2对Lp FQR表面疏水性的影响

目前认为，CSH主要是由菌体表面具有的疏水性蛋白质、糖类等化合物所赋于的一种表面特性[13]，菌体表面的蛋白类物质对细胞具有较好的保护作用[14]。有研究表明[15]，CSH强弱主要取决于其表面非极性基团的比例。

图3 不同浓度NaNO2对FQR 细胞表面疏水性的影响Fig.3 Effect of different concentrations of NaNO2 on cell surface hydrophobicity of FQR

由图3可知，在0～0.120%NaNO2范围内，CSH值呈现上升的趋势，可能由于NaNO2浓度的增加，引起环境中离子强度改变，使得细胞表面蛋白中疏水性基团打开，而表现出CSH增强[11]。在空白和0.045% NaNO2条件下，FQR CSH无显著性差异(P>0.05)，分别(19.70±1.41)%和(21.32±1.33)%，可能0～0.045% NaNO2是菌体能够承受的范围，菌体表面表现出较小的应激反应。在0.120% NaNO2时，CSH值达到最大(41.38%±1.08%)，说明该浓度下细胞表层疏水性基团参与调节。但在0.150% NaNO2时，CSH值又显著降低(P<0.05)，可能是由于细胞表层蛋白遭到破坏，而表现出菌株的表面疏水性减弱[16]。

2.4 不同浓度NaNO2对Lp FQR细胞膜通透性的影响

荧光探针Fluo-3 AM是种高度特异性Ca2+荧光指示剂，研究表明[17]，激发光波长位于可见光区，能有效地避免紫外光激发而引起的细胞自发荧光的干扰和对细胞的损伤。Fluo3与胞内游离钙结合，在488 nm激发光的激发下，525 nm 处观察的荧光强度，胞内Ca2+浓度与荧光强度成正比[18-19]。

本研究利用Fluo3-AM 荧光探针检测FQR胞内Ca2+浓度，比较不同浓度NaNO2对细胞膜通透性的影响，从而评价细胞受伤害的程度。荧光强度越大，胞膜通透性越小，即细胞受伤害程度越小。结果表明，在0～0.150 % NaNO2范围内，随着NaNO2浓度的增大，荧光强度呈下降趋势，相对于空白组分别降低了30.24 %、39.58 %、60.95 %和67.90 %(图4)。说明NaNO2对细胞产生了不同程度的损害，NaNO2浓度越大，细胞膜通透性越高。

图4 不同浓度NaNO2对FQR细胞膜通透性的影响Fig.4 Effect of different concentrations of NaNO2 on membrane permeability of FQR

2.5 不同浓度NaNO2对Lp FQR形态的影响

2.5.1 扫描式电镜观察

Lp FQR分别于含0.045 %、0.120 % NaNO2MRS培养基中培养16 h，以不含NaNO2的MRS培养基为对照。结果表明，在对照和含0.045 % NaNO2条件下，FQR菌体大小均一，呈短杆状，表面光滑，并且个体充盈、饱满(图5 a～b)，细胞表面形态未发现明显变化。

在0.120 % NaNO2浓度下，Lp FQR菌体表面出现褶皱和凹陷(图5c)，说明该浓度已对菌体产生了一定的伤害。但对菌体大小进行测量发现，菌体大小并未出现明显差异，王兰[20]等研究发现NaNO2会导致植物乳杆菌L5 菌体形态发生一定的改变，菌体变成纤细的长杆状，与本试验研究结果有差异，可能是由于菌株的差异性导致。某种程度上，Lp具有较强的自动调节能力，能够减小NaNO2对细胞膜破坏作用。

本研究对扫描电镜电压大小做出一定的选择，发现电压过高菌体表面损伤，如褶皱、甚至胞膜破损等，不易真实呈现，最终选择电压3.0 kV为最佳。

a、b、c分别为FQR在空白、0.045 % NaNO2以及0.120 %条件下培养16 h电镜照片，30.0 k倍图5 不同浓度NaNO2 对FQR菌体形态的扫描电镜图Fig.5 Effect of different concentrations of NaNO2on morphology of FQR by scanning electron microscope

2.5.2 透射式电镜观察

Lp FQR分别于含0.045 %、0.120 % NaNO2MRS培养基中培养16 h，以不含NaNO2的MRS培养基为对照。透射电镜观察发现，对照组中FQR存在大量白色颗粒(图 6 a)；含0.045 % NaNO2的MRS培养基中FQR胞内白色颗粒减少(图 6 b) ；在0.120 % NaNO2条件下，胞内未发现白色颗粒，而出现细胞质空化现象(图 6 c)。据报道[21-22]，白色颗粒物是一种无机磷酸盐(多聚β-羟基丁酸)，是细菌体内常见的能量储存物质，在细胞生长、代谢中具有重要的作用。此外，菌体可通过感应环境信号来调控胞内储能物质。高浓度的NaNO2条件下，Lp白色颗粒的减少，可能是Lp为适应NaNO2胁迫环境，产生应激反应，消耗胞内储能物质所至；细胞空化可能与高浓度的NaNO2引起的细胞膜通透性升高(图 4)，胞质内容物流失有关。

a、b、c分别为FQR在空白、0.045 % NaNO2以及0.120 %条件下培养16 h电镜照片，10.0 k倍图6 不同浓度NaNO2 对FQR菌体形态的透射电镜图Fig.6 Effect of different concentrations of NaNO2 on morphology of FQR by transmission electron microscope

3 结论

NaNO2对Lp FQR的生长、细胞表面性质以及细胞形态均有不同程度的影响。在0～0.150 % NaNO2范围内，随着NaNO2浓度的增大，FQR降解NaNO2能力以及NiR活性均呈下降趋势。

随着NaNO2浓度增大，FQR细胞膜的通透性升高，胞内储能物质减少；菌体表面形态和内部结构发生显著变化，以至于细胞膜表层损伤，NaNO2浓度越大，损伤越明显。这种细胞膜的损伤，可能造成细胞质组分外流，因此导致Lp对高浓度NaNO2的降解能力下降。

本研究从细胞学角度探明了高浓度NaNO2对Lp细胞表面特性的改变及其细胞质膜的破坏作用，为进一步深入研究Lp对NaNO2的应答调控机制奠定了基础。

[1] 周光宏.畜产品加工学[M].北京:中国农业出版社,2002, 101-103.

[2] KIM I S,JIN S K,HUR I C, et al. Effect of tomato powder on meat patties as nitrite alternatives [J]. Korean Journal for Food Science of Animal Resources, 2009, 29(3): 382-390.

[3] KAROLINA M W,MAGORZATA K, ZBIGNIEW J D. Use of acid whey and mustard seed to replace nitrites during cooked sausage production [J]. Meat Science, 2014, 96(2): 750-756.

[4] WU C D, ZHENG J, HUANG J, et al. Reduced nitrite and biogenic amine concentrations and improved flavor components of Chinese sauerkraut via co-culture ofLactobacillusplantarumandZygosaccharomycesrouxii[J]. Annals of Microbiology, 2014, 64(2): 847-857.

[5] YAN P M, XUE W T, TAN S S, et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai [J]. Food Control, 2008, 19(1): 50-55.

[6] FEI Y T, LIU D M, LUO T H, et al. Molecular characterization ofLactobacillusplantarumDMDL 9010, a strain with efficient nitrite degradation capacity[J]. PLoS ONE, 2014, 9(11): e113792. DOI:10.1371/journal.pone. 0113792.

[7] 王盼, 费永涛, 刘冬梅, 等. 植物乳杆菌DMDL 9010 中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化[J]. 现代食品科技, 2015, 31( 6): 150-155.

[8] 安浩然.长双歧杆菌BBMN68抗胆盐胁迫反应机制及双组分系统在胆盐胁迫应答中的作用[D].北京:中国农业大学, 2014.

[9] 中华人民共和国卫生部. GB 5009.33-2010食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定[S].北京:中国标准出版社, 2010.

[10] 张馨月,刘冬梅,许喜林,等.LCR 6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原酶的初步定位[J].现代食品科技,2013,29(11): 2 627-2 632.

[11] 任大勇.益生乳酸杆菌的黏附及免疫调节作用研究[D].吉林:吉林大学, 2013.

[12] 李宝坤,田丰伟,刘小鸣.冷冻干燥对乳酸菌代谢活力的影响[J].食品工业科技, 2011, 32(9): 203-209.

[13] SCHR-ZAMMARETTI P, UBBINK J.The cell wall of lactic acid bacteria: surface constituents and macromolecular conformations [J]. Biophysical Journal, 2003, 85(6): 4 076-4 092.

[14] GREENE J D, KLAENHAMMER T R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells[J]. Applied Environmental Microbiology, 1994, 60(12): 4487-4494.

[15] 周丹.益生性乳杆菌细胞表面特性研究[D].长沙:湖南农业大学, 2011.

[16] 朱晓.乳酸菌表层蛋白的性质、结构与功能[D].无锡:江南大学, 2012.

[17] WANG H L,ZHOU G D,GAI H W,et al.A fluorescein-based probe with high selectivity to cysteine over homocysteine and glutathione [J].Chemical Communications,2012, 48(67): 8 341-8 343.

[18] CHRZANOWSKI T H,CROTTY R D,HUBBARD J G. Applicability of the fluorescein diacetate method of detecting active bacteria in freshwater[J].Microbial Ecology,1984,10(2): 179-185.

[19] 王飚,田丰伟,励建荣.冷冻干燥对乳酸菌细胞膜通透性的影响[J].微生物学通报,2009, 36(5): 684-688.

[20] 王兰, 邓放明, 陈思思. 植物乳杆菌L5降解亚硝酸盐机理的初步研究[J].食品与发酵工业,2014, 40(12): 120-124.

[21] BROWN M R,KORNBERG A.Inorganic polyphosphate in the origin and survival of species[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004, 101(46): 16 085-16 087.

[22] RAO N N,GOMEZ-GARCIA M R,KORNBERG A.Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival[J].Annual Review of Biochemistry,2009, 78(78): 605-647.

Effect of nitrite on the cell surface property and morphology ofLactobacillusplantarumFQR

WEI Tian, MEI Lin*, WANG Zhi-geng, XUE Xiu-heng

(School of Tea and Food Science& Technology, Anhui Agriculture University, Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui, Heifei 230036，China)

Effects of different concentrations of NaNO2on the degradation ability, nitrite reductase (NiR) activity and cell surface properties ofLactobacillusplantarum(Lp) FQR were investigated, and the cell morphology of which was observed by electron microscope. The results showed that the degradation ability and NiR activity of FQR was decreasing with the increase of NaNO2concentrations within 0-0.150%. Under the condition of 0.045% NaNO2, FQR could efficiently degrade NaNO2within 16 h with (94.85±2.96)% of degradation rate and (174.60±13.67) U/104of NiR activity. In addition, high concentrations of NaNO2could also contribute to the significant increase of cell surface hydrophobicity and membrane permeability. There were no differences in cell surface morphology of FQR between the nitrite-free group and 0.045% NaNO2group, whereas the surface of FQR exposed to 0.120% NaNO2appeared depression and wrinkle by observation through scanning electron microscope. FQR in nitrite-free group exhibited numerous energy storage granules, number of which decreased obviously with increasing concentration of NaNO2. The intracellular energy storage material almost disappeared, and external flow of cytoplasm was observed through transmission electron microscope when FQR exposed to 0.120% NaNO2. In summary, high concentrations of NaNO2can cause changes in the surface morphology and internal structure of bacteria obviously.

nitrite;Lactobacillusplantarum; nitrite reductase; cell surface property; electron microscope

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703008

硕士研究生(梅林副教授为通讯作者,E-mail：meilin8880@sina.com.cn)。

安徽省生猪产业技术体系建设专项资金(ahszcytx-5)

2016-05-10，2016-07-19