鸭肝炎病毒多克隆抗体的制备与鉴定

高蕾蕾+张巫凡+张聪+相朝锋+王臣

摘 要：本试验旨在建立鸭肝炎病毒多克隆抗体。通过鸭肝炎病毒（DHV-I）在鸡胚尿囊腔中增殖，收集尿囊液作为免疫原，并制定免疫程序，动物免疫后获得兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体；同时通过酶联免疫吸附试验测定多克隆抗体水平，硫酸铵盐析法提纯兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体。在研究中获得了较高纯度的兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体，为进一步建立鸭病毒性肝炎的诊断与检测技术奠定实验基础。

关键词：鸭肝炎病毒；多克隆抗体；酶联免疫法；硫酸铵盐析法

鸭病毒性肝炎（DVH）是由鸭肝炎病毒（DHV-I）引起的雏鸭的一种高度致死性传染病，以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征。临床表现痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状，以肝肿胀和出血为特征性病变。多克隆抗体是由多种抗原决定簇刺激机体产生各种各样的单克隆抗体混杂而成。它具有识别多个抗原表位、抗原与抗体特异性结合、制备时间短、成本低等优点，广泛应用于研究和诊断方面。本研究目的为制备鸭肝炎病毒多克隆抗体，为进一步建立鸭病毒性肝炎的诊断与检测技术奠定实验基础。

一、材料与方法

1.试验材料

鸭肝炎病毒XZ株由河南科技大学预防兽医实验室分离保存；2 kg 成年兔两只购于孙旗屯；10日龄鸡胚11枚购于洛阳现代禽业有限公司。

2.鸭肝炎病毒鸡胚尿囊腔增殖

将鸭肝炎病毒注射到10日龄鸡胚尿囊腔，收集24-72 h鸡胚的澄清尿囊液，同时测定鸡胚尿囊液的鸡胚半数感染量。

3.动物免疫程序及兔抗鸭肝炎病毒多抗血清的收集

两只成年兔分为两组，一只实验组，一只对照组；抗原注射以前收集5 mL正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。多点注射鸭肝炎病毒鸡胚尿囊增殖液1 mL；对照组正常饲养。一免一周后，采集实验兔血液1 mL，放入28℃培养箱1 h后，再放入 4℃冰箱24 h，台式离心机7000 r/min离心5 min，分离出血清，4 ℃保存备用。一免二周后，采集实验兔血液1 mL，分离出血清，4 ℃保存备用；同时进行加强免疫，1 mL尿囊液背部多点注射。二免一周后，采集实验兔血液1 mL，分离出血清，4 ℃保存。同时进行三免，1 mL尿囊液背部多点注射。三免一周后，进行心脏采血40 mL，分离出待检血清，4 ℃保存。

4.间接ELISA法检测兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体

分别于鸭肝炎病毒鸡胚尿囊液首免实验兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采集血液，分离得到的血清采用间接ELISA法检测兔抗鸭肝炎病毒血清多克隆抗体OD450值。

5.硫酸铵盐析法提纯兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体

采用硫酸铵盐析法粗提纯兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体。在紫外分光光度仪上测定多克隆抗体溶液的OD280和OD260值。

按公式计算：蛋白质浓度（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释度。

二、结果与分析

1.鸭肝炎病毒鸡胚增殖情况分析

鸭肝炎病毒接种10龄鸡胚后，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集24-72 h鸡胚澄清的尿囊液。测定鸭肝炎病毒鸡胚尿囊增殖液的鸡胚半数感染量，检测结果为：2.5×106/mL。

2.兔血清中抗鸭肝炎病毒多克隆抗体的动态变化

采用鸭肝炎病毒鸡胚尿囊腔增殖液作为免疫原免疫成年兔，免疫兔后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d采血并分离血清，通过间接ELISA法检测兔血清中兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体的OD450值。间接ELISA法检测结果如图1显示，血清中兔抗鴨肝炎病毒多克隆抗体OD450呈上升趋势。

3.血清中兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体含量

采用硫酸铵盐析法提纯第28 d兔血清。紫外分光光度计测定多克隆抗体吸光度。根据公式计算多克隆抗体浓度为10.153 mg/mL。

三、讨论

鸭病毒性肝炎最先发现于美国，其后，在英国、法国、德国、意大利、加拿大、印度等国陆续地报道有本病发生。1963年我国首次报道了上海某鸭场于1958年秋至1962年春暴发本病的情况。此后，全国各地都相继报道了本病的爆发与流行。1980年至今，在我国多个地区已多次爆发该病，流行区域广，且发病严重，却没有被很好地控制，仍然在主要的养鸭地区间歇发生，给我国的养鸭业带来了巨大的损失。鸡胚尿囊腔增殖鸭肝炎病毒，获得了病毒增殖液，测得鸡胚半数感染量为2.5×106/mL；间接ELISA实验结果表明，血清中兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体水平逐渐升高；硫酸铵盐析法提纯兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体，紫外分光光度计检测血清中兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体浓度为10.153 mg/mL，通过鸭肝炎病毒在鸡胚尿囊腔中增殖，收集的尿囊液作为免疫原，免疫家兔后获得了兔抗鸭肝炎病毒多克隆抗体，为进一步建立鸭病毒性肝炎的诊断与检测技术奠定实验基础。

参考文献：

[1] Saif Y M， Bames H J， Fadly A M. Diseases of Poultry （1lth Edition） [M]. America： Iowa State Press.2003：339-351.

[2] 范伟兴，袁秀芳.1株鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定[J].中国兽医杂志，2000，26：17-18.

作者简介：高蕾蕾（1994- ），女，河南濮阳人，本科学历。

王臣（1979- ），男，安徽六安人，博士学历，副教授，研究方向：动物分子病原学与免疫学。