采用在体单向肠灌流模型研究荷叶多成分整体的肠渗透性

尹秀文+侯成波+陈江鹏+潘孟+李雪莲+王子禹+董玲

[摘要] 研究荷叶多成分整体的肠渗透性，明确荷叶成分间吸收过程中的相互作用。采用大鼠在体单向灌流法。结果表明，荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚7种单体成分的有效渗透系数（Peff）大于0.5×10-4 cm·s-1，在生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）肠渗透属性中，属高渗透性成分，而儿茶素、金丝桃苷为低渗透性成分。然而，在荷叶总提取物多成分环境下，成分的渗透行为发生了变化，对荷叶中不明确成分进行半定量分析发现，在多成分环境下，可标识的9个成分中有3个成分Peff小于0.5×10-4 cm·s-1。在多成分环境下，7个未知成分中，3个成分属于高渗透性成分，4个成分属于低渗透性成分。该研究初步明确了荷叶中多成分整体的肠渗透性，为揭示中药多成分环境下的吸收机制奠定一定的基础。

[关键词] 单向肠灌流；渗透性；荷叶；中药生物药剂学分类系统

Overall intestinal permeability of multiple components in

lotus leaf by in situ single pass intestinal perfusion models

YIN Xiu-wen， HOU Cheng-bo， CHEN Jiang-peng， PAN Meng， LI Xue-lian，WANG Zi-yu， DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To investigate the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaves and make clear the interaction in composition absorption process. Rat single-pass intestinal perfusion technique was used， and the results showed that the Peff values of nuciferine， demethylanuciferine， rutin， quercetin， kaempferol from lotus leaf were greater than 0.5×10-4 cm·s-1. In the biopharmaceutics classification system （BCS） intestinal permeability property， these ingredients were high permeable components， while the hyperin was low permeable component. However， in the multi-component environment of the lotus leaf extract， component permeation was changed. Semi quantitative analysis of the unclear components showed that under the multi-component environment， four in seven components with relatively high contents had a Peff value less than 0.5×10-4 cm·s-1， indicating these 4 components were of low permeability， while other 3 components were of high permeability. The results could be valuable to make clear the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaf， and lay a foundation for studying the mechanism of the lipid-lowering effect of lotus leaf.

[Key words] single-pass intestinal perfusion（SPIP）； permeability； lotus leaf； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

口服作為药物最常见的服用方式，其胃肠道吸收过程非常复杂。药物的水溶解性及肠渗透性是影响吸收的主要因素[1]，也是影响药物生物利用度的关键因素之一。“生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）”是根据药物的水溶解性及肠渗透性高低，对药物进行分类的一种科学框架或方法[2-3]。BCS的提出是基于单一成分化学药物，而中药与化药口服吸收的本质和核心是一致的。成分在肠道吸收受很多因素影响，对中药整体肠吸收研究，需要经过单成分到多成分环境的递进过程，才能明确成分在多成分环境下的吸收变化差异。基于中药的多成分属性本课题组提出了中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）[4]。本文在研究中药多成分环境下的渗透性时，首先要对吸收的目标成分进行锁定，同时要充分考虑多成分环境下其他成分对目标成分的影响，然后再对吸收成分的吸收程度进行系统分析和定量研究。

小肠是药物吸收的重要部位，目前，预测药物小肠吸收的方法主要有分为体外法、离体法、在体法3种[5-7]。体外法主要有Caco-2细胞模型、平行人工膜等，离体法主要采用翻转肠囊实验，离体法则涉及翻转肠囊法。体内法通常采用经典的单向肠灌流法、以及肠灌流并行采血法。本课题组前期通过离体法翻转肠囊实验研究了荷叶中荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、紫云英苷的肠渗透性，但由于儿茶素、去甲基荷叶碱，山柰酚等成分在荷叶总提取物中含量本身比较低，翻转肠囊实验未能进一步探索其肠渗透情况，该方法对成分的判断有失准确[8]。为了进一步对荷叶成分进行肠渗透性定量分析，本研究采用大鼠在体单向肠灌流（SPIP）实验对荷叶中确定单成分进行灌流实验，该方法较好地模拟人体的体内环境，不损伤研究部位的循环系统和生理环境，且结果与人体试验结果相关性良好[9-10]。古籍记载荷叶具有减肥降脂的功效[11]，荷叶多成分是通过多靶点发挥降脂减肥作用[12-14]。本研究选用荷叶为研究对象，采用在体单向肠灌流模型，研究荷叶多成分整体的肠渗透性，明确荷叶多成分中的易吸收透过肠壁和难于透过肠壁屏障的成分，为中药生物药剂学分类系统的后续研究提供一定的理论和技术参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司）；BT-25S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW-4 电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超聲仪器有限公司）；STARTER2100实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（GL-21M，上海沪湘仪离心机有限公司）。

1.2 药物与试剂

荷叶药材购自中国北京同仁堂（集团）有限责任公司，经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuifera Gaertn的干燥叶，对照品叶碱（批号J04M6Y1，上海源叶生物科技有限公司）、芦丁（批号Y05M6S1，上海源叶生物科技有限公司）、金丝桃苷（批号08916-418，美国ChromaDex）、异槲皮苷（批号HJ0604XA13，上海源叶生物科技有限公司）、槲皮素（批号Y26D5Y1，上海源叶生物科技有限公司）、紫云英苷（批号KS0910CB14，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈购买于美国Fisher公司（色谱级）；磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂（分析级）；娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司（中国杭州）。

1.3 动物

SD大鼠，雄性，体重200～250 g，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证号SCXK（京）2011-0004。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液

精密称取各对照品5.0 mg于10 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，得500 mg·L-1对照品储备液。精密量取各储备液3.0 mL于50 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀后，精密量取各对照品适量于50 mL量瓶，甲醇定容，摇匀，即得一定浓度的混合对照品溶液。

2.1.2 Krebs-Ringer′s营养液（K-R液）

称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去离子水定容至1 000 mL，即得。

2.1.3 荷叶提取物溶液的制备

荷叶药材粉碎，得粗粉，称取5 g，以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h，提取液趁热抽滤，放冷定容至250 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。

2.1.4 灌流液制备

称取适量的荷叶对照品，以K-R液溶解得到不同浓度的肠灌流液。取荷叶醇提液用K-R液稀释至一定生药浓度的灌流液。

2.2 荷叶多成分HPLC分析方法的建立

2.2.1 色谱条件

2.2.1.1 荷叶可标识单成分色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相水（A，含0.025%磷酸）-乙腈（B），梯度洗脱。各成分检测波长、流速、流动相比例见表1。

2.2.1.2 荷叶提取物色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长270 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相0.025%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱 （0～2 min，98∶2；2～5 min，98∶2～92∶8；5～8 min，92∶8；8～11 min，92∶8～88∶12；11～17 min，88∶12；17～25 min，88∶12～85∶15；25～43 min，85∶15；43～61 min，85∶15～74∶26；61～70 min，74∶26；70～89 min，74∶26～25∶75；89～90 min，25∶75；90～98 min，25∶75～98∶2；98～120 min，98∶2）。

2.2.2 定量分析方法学考察

2.2.2.1 专属性考察 荷叶可标识单成分：分别取空白肠灌流液、含对照品灌流液进行HPLC检测分析，空白肠灌流液对荷叶定量成分检测无影响，说明方法专属性良好，结果见图1。

荷叶多成分：分别取空白肠灌流液、含混标对照品灌流液进行HPLC检测分析，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，说明方法专属性良好，结果见图2。

2.2.2.2 线性与范围 荷叶可标识单成分：分别量取一定体积0.5 g·L-1的对照品储备液于容量瓶中并定容，配成不同浓度的对照品溶液，分别精密取上述对照品溶液20 μL注入高效液相，记录各成分峰面积，以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好，见表2。

荷叶多成分：分别量取一定体积0.5 g·L-1的对照品储备液于量瓶中并定容，配成不同浓度的混标溶液，分别精密取上述混标溶液20 μL注入高效液相，记录峰面积，以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好，结果见表3。

2.2.2.3 精密度考察 荷叶可标识单成分：分别配制不同浓度的对照品溶液，重复进样6 针，记录峰面积，计算RSD。各浓度下RSD均小于2%，说明方法精密度良好。

荷叶多成分：分别配制不同浓度的混合对照品溶液，重复进样6针，记录峰面积，计算RSD。各浓度下，RSD均小于2%，说明方法精密度良好。

2.2.2.4 重复性考察 荷叶可标识单成分：分别精密量取对照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s试液定容，摇匀后，以甲醇稀释至一定比例，样品通过0.22 μm微孔滤膜后进行HPLC检测，记录峰面积，并计算RSD，所有样品重复操作5次。结果表明RSD均小于2%，说明方法重复性良好。

荷叶多成分：分别精密量取对照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s试液定容，摇匀后即得一定濃度的混合对照品溶液，以甲醇稀释至一定比例，样品过膜后进行HPLC检测，记录峰面积，计算RSD，样品重复操作6次。结果RSD<3%，说明方法重复性良好。

2.2.2.5 回收率考察 荷叶可标识单成分：取空白肠灌流液，分别加入不同量的对照品，以HPLC测定其含量，计算回收率，样品回收率RSD在95.28%～100.8%，说明方法准确度良好。

荷叶多成分加样回收率考察：取指标成分已知浓度的荷叶提取物肠灌流液，分别加入不同量的对照品，以HPLC测定其含量，计算回收率，结果表明回收率在86.85%～105.7%。

2.3 荷叶单成分肠渗透性研究

2.3.1 大鼠在体肠灌流操作方法

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 μL·g-1）麻醉。沿中线打开腹部，选取合适长度肠段，用生理盐水冲洗干净。注射泵与肠段入口端相连，设置灌流速度为0.2 mL·min-1，持续灌流约30 min吸收达到稳定后重新计时，每隔15 min用已知质量的小瓶在肠段出口端收集流出药液，计算收集前后小瓶重量称量差，同时测定收集液的密度，以此方法来进行灌流液的体积校正。实验结束后剪下被灌流的肠段并处死大鼠，测量肠段的长度及内径。HPLC测定流出灌流液中待测成分含量。

2.3.2 在体单向肠灌流法相关计算方法[15]

在体灌流法肠有效渗透系数Peff计算公式如下。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/C0）2πrL

Qout=Mout/Doutt

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qin为灌流液流速（mL·min-1）；C0为灌流液荷叶成分的初始浓度（mg·L-1）；L是灌流肠段长度（cm）；r为灌流肠段半径（cm）；Cout（cor）荷叶成分灌流收集液校正浓度（mg·L-1）；Qout为灌流液流出的流速（mL·min-1）；Cout为灌流收集液中荷叶成分的浓度（mg·L-1）；Dout为灌流收集液密度（g·mL-1）；t为取样周期（min）；Mout为灌流收集液质量（g）。

3 结果

3.1 荷叶可标识单成分、多成分HPLC图的建立

3.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图的建立

3.1.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图 本研究建立了荷叶可标识单成分HPLC图谱，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，说明方法专属性良好，结果见图1。

3.1.1.2 荷叶可标识单成分标准曲线绘制 以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好，见表2，

3.1.2 荷叶多成分HPLC图的建立

3.1.2.1 荷叶多成分HPLC图 为了考察荷叶成分吸收变化情况，本研究建立了荷叶化学成分HPLC图谱，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，说明方法专属性良好，结果见图1。

3.1.2.2 荷叶多成分标准曲线绘制 以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果表明各对照品在相应浓度范围内线性关系良好，见表3。

3.2 荷叶多成分肠渗透性研究

3.2.1 荷叶可标识单成分吸收

采用在体单向灌流对荷叶中明确的单成分进行渗透性研究，荷叶中可标识单体成分有效渗透系数见表4，可以看出荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚成分Peff大于0.5 ×10-4cm·s-1，在BCS肠渗透属性中，这些成分为高渗透性成分，而儿茶素、金丝桃苷为低渗透性成分。

3.2.2 荷叶提取物吸收情况

3.2.2.1 荷叶提取物中可标识成分吸收情况 在荷叶多成分环境下，可标识成分有效渗透系数见表5，结果表明，单成分仅有儿茶素、金丝桃苷是低渗透性药物成分，但是在多成分环境下，成分的渗透行为并不是一成不变的，去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分整体渗透率有降低的趋势，芦丁的渗透系数出现了跨象限的现象，多成分环境下，芦丁成分由高渗透性变为低渗透性，而山柰酚渗透系数则增大。

3.2.2.2 荷叶提取物中不可标识成分吸收情况 由HPLC图，选取已知成分异槲皮苷作为内标物，计算其他较高含量成分的相对保留时间及相对含量，并计算其肠有效渗透系数，结果见图3，表6。

结果表明，其他含量比较高的成分中7个成分中，X1，X2，X6的Peff大于0.5×10-4 cm·s-1，依据BCS属于高渗透性成分，成分X3，X4，X5，X7则低于该值，属于BCS的低渗透性成分。

4 讨论

4.1 荷叶整体肠渗透性实验结果与讨论

对荷叶中已知的单成分进行了肠渗透性考察，既定成分已经有了比较明确的肠渗透归属，9个成分中仅有儿茶素与金丝桃苷的Peff小于0.5×10-4 cm·s-1，其他成分均大于该限度，儿茶素与金丝桃苷属于低渗透性成分，而其他成分为高渗透性成分。但是，在荷叶总提取物这一复杂环境下，对应成分的肠渗透性情况可能会发生变化，最为显著的是芦丁的渗透系数出现了跨象限的现象，多成分环境下，芦丁成分由高渗透性变为低渗透性，多成分环境下，荷叶中的去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分整体渗透率有降低的趋势，而山柰酚渗透系数增大，可能是其他成分促渗作用导致。因此，研究清楚荷叶多成分在整体环境下的肠渗透性，明确多成分环境下成分吸收变化规律具有重要的意义。

4.2 基于肠渗透性的成分吸收评价研究

肠渗透性是药物进行BCS分类的基本属性之一[16]，根据其强弱将药物分为高渗透性药物（强吸收成分）和低渗透性药物（弱吸收成分）[2]。就中药而言，中药成分本身渗透性有差异，同时多成分环境下也会导致渗透性产生差异，因此在考察成分渗透性时，要同时考察对单成分渗透行为和整体多成分环境对渗透性的影响。药物的渗透性差异，其吸收行为就有差异，必然导致其发挥药效的机制不同，对于高渗透性的药物，药物多是吸收进入体内发挥疗效，而对于低渗透性药物，则多是滞留在肠道内，因此在研究药物发挥疗效的机制时，对于肠渗透性差的药物，可以考虑基于肠道吸收前靶点的活性研究，而对于肠渗透性较好的药物成分，考虑其在吸收过程中以及吸收后靶点药效研究。

荷叶是经典的药食两用的减肥药材，降脂减肥的临床功效得到普遍认可，荷叶中含有大量的减肥有效成分，主要是生物碱类和黄酮类成分，还有多酚类、有机酸类成分等[17]。但其发挥减肥作用的机制尚不明确，其中脂肪酶抑制是非常典型降脂减肥机制，针对荷叶生物碱、黄酮总提取物以及部分单体成分的脂肪酶抑制活性已经有研究[18]，但各成分之间协同作用，如何发挥疗效，未见文献报道。为了明确荷叶多成分的减肥降脂机制，首先对荷叶进行吸收行为考察，结果发现，荷叶多成分中有渗透性好的成分，也有肠渗透性差的成分，且多成分环境下肠渗透性受到成分间相互作用影响发生改变。因此，研究荷叶发挥降脂的机制，低渗透性成分可能因在肠道滞留时间长，结合像脂肪酶一样的肠道吸收前靶点发挥作用，而高渗透性成分如荷叶碱，可能是吸收过程中或吸收进入体内经过其他降脂靶点发挥疗效，除此之外，还要考虑荷叶多成分在发挥药效时的相互影响。综上所述，荷叶发挥减肥降脂的机制及其关系，需进一步研究。

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[责任编辑 孔晶晶]