一种薤白中性多糖的结构鉴定及体外抗氧化活性研究

张占军,王富花,葛 洪,张 军,李海凤

(1.扬州市职业大学工程研究中心,江苏扬州 225009; 2.扬州工业职业技术学院,江苏扬州 225127; 3.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

一种薤白中性多糖的结构鉴定及体外抗氧化活性研究

张占军1,3,王富花2,葛 洪1,张 军1,李海凤1

(1.扬州市职业大学工程研究中心,江苏扬州 225009; 2.扬州工业职业技术学院,江苏扬州 225127; 3.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

采用分步醇沉和柱层析的方法,从薤白中分离纯化得到一种中性多糖AMP60N,其重均分子量为11200 u,由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖构成,经红外光谱分析,同时结合高碘酸氧化、Smith降解及GC分析等手段,通过甲基化以及核磁共振波谱分析,初步确定了AMP60N主要由Glc(1→2)和Ara(1→5)构成,以Gal(1→6)和Glc(1→6)为支链的分子结构组成。对AMP60N清除各种自由基的研究表明其具有一定的体外抗氧化活性，呈现明显的量效关系，其抗氧化能力弱于VC。

薤白,多糖,结构鉴定,抗氧化活性

薤白(AlliummacrostemonBunge),为百合科葱属多年生草本植物,又名小根蒜、野白头、山蒜、苦蒜、小么蒜、小根菜、野蒜、野葱等,属药食两用植物,我国大部分地区均有分布,其新鲜根茎叶均可作为蔬菜食用,中药中使用的薤白为将其茎叶及须根除去后,经沸水煮透,晒干或烘干后的炮制品[1]。已有研究发现,薤白中含有挥发油、甾体皂甙、含氮化合物及多糖等多种活性成分,具有抗氧化、抑菌、抑癌、抑制血小板聚集、调血脂、抗动脉粥样硬化、镇痛和耐缺氧等多种生理活性[2]。

多糖是自然界中广泛存在的一类生物大分子,因其具有的稳定性、安全性、生物相容性和丰富的生物活性等优势,被广泛应用于食品、医药、饲料和化妆品等领域,深受人们关注。抗氧化活性是多糖重要的生理活性之一,已从自然界中发现大量的具有明显抗氧化作用的多糖。前期已对薤白粗多糖体外抗氧化活性及其对小鼠急性肝损伤的保护作用进行了研究[3],本研究拟对薤白多糖60%醇沉组分进行纯化、结构鉴定及抗氧化活性进行研究,以期为薤白多糖基础研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薤白(野白头) 购于安徽慧隆中药饮片有限公司,产地江苏丹阳;氯化钠、盐酸、氢氧化钠、苯酚、硫酸、考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、三氟乙酸、碘酸钠、乙二醇、硫酸钠、溴化钾等试剂 均为国产分析纯;吡啶、盐酸羟胺、醋酸酐、肌醇、碘甲烷等试剂 均为国产色谱纯;DEAE-纤维素-52、Sephadex G-100、Pullulan、牛血清白蛋白、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖、半乳糖等试剂 购自美国Sigma公司。

H8453紫外可见分光光度仪 美国惠普公司;BRUKER-VECTOR22型傅立叶变换红外光谱仪 德国布鲁克光谱仪器;HP 1100高效液相色谱系统(配有示差折光检测器和数据处理系统) 美国惠普公司;GC-16型气相色谱仪 日本岛津公司;722S型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;HL-2B恒流泵与DBS-100A型自动部份收集器 上海沪西分析仪器厂;Alpha 1-2型冷冻干燥机 英国LABCONCO公司;Bruker DRX-600型核磁共振仪 瑞士Bruker公司;MS Varian Satum 2200型气相-质谱联用仪 美国Varian公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 薤白烘干后粉碎,取过60目筛后粉末加石油醚回流脱脂3 h,固液分离后烘干,90%乙醇回流1 h,残渣经干燥粉碎,得薤白预处理样品,保存备用。

1.2.2 薤白多糖的分步醇沉 取薤白预处理样品置圆底烧瓶中,按质量体积比1∶12(g/mL)加入去离子水,87 ℃温度下搅拌提取100 min,提取结束后离心(5000 r/min,10 min),收集上清液,残渣重复提取2次。上清液合并后减压浓缩至一定体积,加乙醇至最终体积分数为40%,5000 r/min离心10 min,取上清液,上清液浓缩至无醇后,加乙醇至终浓度为60%,离心取沉淀物,冻干得薤白60%醇沉组分为粗多糖(AMP60)。

1.2.3 薤白粗多糖AMP60的分离纯化 薤白粗多糖经DEAE-纤维素-52交换柱色谱进行初步分离纯化,再用葡聚糖凝胶Sephadex G-100色谱柱进行进一步纯化[4]，得到中性多糖AMP60N。

1.2.4 薤白多糖的基本理化性质分析 多糖样品采用苯酚-硫酸法[5]测定总糖含量,采用考马斯亮蓝法测定糖醛酸含量,采用氯化钡-明胶比色法测定硫酸基含量。

1.2.5 薤白多糖结构分析

1.2.5.1 单糖组成分析 薤白多糖样品的单糖组成分析,采用糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱法[6]。色谱柱:HP-5(0.25 μm×0.32 mm×30 m);程序升温:120 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至210 ℃,保持4 min;进样口温度250 ℃,检测器温度280 ℃,进样量1.0 μL。

1.2.5.2 分子质量测定 采用高效液相凝胶渗透色谱法[4],进行薤白多糖的纯度鉴定及相对分子质量测定。色谱柱:TSK-Gel G3000 SWxl(7.8 mm×300 mm,5 μm);柱温25 ℃,示差检测器,流动相为含0.1 mol/L Na2SO4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8),流速0.7 mL/min,进样量20 μL。

1.2.5.3 红外光谱分析 采用KBr压片法进行薤白多糖样品的红外光谱分析[7]。取薤白多糖样品,按1∶100比例与KBr研磨后压成薄片,以KBr为参照物,在4000～500 cm-1范围内进行红外光谱测定。

1.2.5.4 高碘酸氧化、Smith降解及GC分析 高碘酸氧化、Smith降解反应参照文献[8]报道的方法经适当修改进行。即取25 mg薤白多糖,溶于NaIO4溶液,4 ℃暗处反应,间歇振荡,至吸光值基本稳定,计算NaIO4消耗量。加乙二醇还原过量的高碘酸,取反应液用NaOH溶液进行滴定,计算甲酸的生成量。反应液加硼氢化钠,静置反应,反应完全后加少量乙酸分解多余的硼氢化钠,然后自来水流水透析24 h,去离子水透析24 h。收集透析液,50 ℃减压蒸发至干,加入三氟乙酸水解,制备糖腈乙酸酯衍生物,最后用气相色谱法进行检测。

1.2.5.5 甲基化分析 薤白多糖样品的甲基化及GC/MS分析,参照文献[9]报道的方法稍作修改。具体如下:取20 mg干燥的薤白多糖样品于带塞离心管中,加入1.0 mL的二甲基亚砜,超声波并漩涡振荡,加入制备好的NaOH-DMSO混悬液及碘甲烷,加盖密封,反应完全后加去离子水终止甲基化反应。反应液转入透析袋,去离子水透析48 h,冷冻干燥得甲基化多糖产物。产物经红外光谱检测,应在3400 cm-1附近无羟基的特征吸收峰,否则,重复上述操作。将甲基化完全的薤白多糖制备成糖腈乙酸酯衍生物,进GC-MS分析。色谱条件:DB-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);程序升温,初温80 ℃,保温1 min,以8 ℃/min升至210 ℃,保温1 min,再以20 ℃/min升至260 ℃,保温1 min。载气为氦气,进样口温度250 ℃,分流比1∶50,柱流速1.0 mL/min,质荷比(m/z)扫描范围30～450,扫描速率2.5 scan/s。

1.2.5.6 核磁共振波谱分析 称取30 mg薤白多糖样品,溶于D2O,经核磁共振波谱仪进行1H-NMR和13C-NMR光谱分析,以四甲基硅烷(TMS)为内标。

1.2.6 体外抗氧化活性研究 以VC作为对照品,对薤白多糖AMP60N清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基进行清除能力测定,所有数据均测定3次,以平均值±标准差方式表示。

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定 清除DPPH自由基能力的测定参照Xu等[10]报道的方法稍作修改。即取0.4 mmol/L的DPPH乙醇溶液0.5 mL,加入3.0 mL不同浓度(0.5～6.0 mg/mL)AMP60N溶液,混匀后于 25 ℃温度下避光反应 30 min,然后在 517 nm波长下测定其吸光度。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：A0为去离子水代替多糖样品的吸光值,A1为多糖样品测定吸光值,A2为无水乙醇代替DPPH溶液的吸光值。

表1 AMP60N的基本理化性质Table 1 Preliminary characterization of AMP60N

注:-:未检出。

1.2.6.2 羟基自由基(OH·)清除能力的测定 清除羟基自由基(OH·)能力的测定按照文献报道的方法[11]并稍作修改。具体为1.0 mL不同浓度(0.5～6.0 mg/mL)的AMP60N样品,与1.0 mL硫酸亚铁溶液(9 mmol/L),1.0 mL 水杨酸乙醇溶液(9.0 mmol/L),混匀后加入1.0 mL H2O2溶液(0.025%,w/v),在25 ℃温度下反应60 min,用分光光度计在波长510 nm下测定吸光值。

羟基自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0为去离子水代替多糖样品的吸光值,A1为多糖样品测定吸光值,A2为去离子水替代H2O2溶液的吸光值。

超氧阴离子自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0为去离子水代替多糖样品的吸光值,A1为多糖样品测定吸光值,A2为磷酸缓冲液替代NBT溶液的吸光值。

1.3 数据处理

实验数据以平均值±标准差方式表示,采用Origin Pro 9.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 AMP60的分离纯化

2.1.1 AMP60的DEAE-纤维素-52色谱法分离 将薤白多糖60%醇沉组分AMP60溶于适量去离子水中,进行DEAE-52纤维素柱层析,依次用去离子水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脱,自动收集器10 mL/管分部收集,苯酚硫酸法检测各管糖含量,绘制洗脱曲线,如图1所示。

图1 AMP60的纤维素色谱洗脱曲线Fig.1 Elution profile of AMP60 on DEAE cellulose-52 column

从图1可以看出,薤白多糖60%醇沉组分AMP60经DEAE-52纤维素柱层析后,多糖主要集中在去离子水洗脱部分,为中性多糖组分FN,其占AMP60的比例为53.74%。

2.1.2 FN的Sephadex G-100凝胶柱纯化 经DEAE-52纤维素色谱柱初步纯化的组分FN经Sephadex G-100凝胶柱色谱进一步纯化,得到1个纯化组分,命名为AMP60N,纯化得率为62.63%。

2.2 AMP60及AMP60N的基本理化性质

薤白多糖60%醇沉组分AMP60及其纯化组分AMP60N的总糖、蛋白质、糖醛酸及硫酸基含量如表1所示。

2.3 单糖组成分析

将AMP60N制备成糖腈乙酰酯衍生物后进行GC分析,保留时间与标准单糖的气相色谱图对照,从图2可以看出,薤白多糖AMP60N由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖构成,3种单糖的摩尔比为9.73∶1.10∶1.00。

图2 标准单糖(a)、AMP60N(b)糖腈乙酰酯衍生物的气相色谱图Fig.2 GC chromatograms of derivatives of standard monosaccharide(a)and AMP60N(b)

2.4 纯度鉴定及相对分子质量测定

通过高效液相凝胶渗透色谱法,对AMP60N进行纯度鉴定及相对分子质量测定。

表2 AMP60N甲基化糖残基的GC/MS数据Table 2 GC/MS date of methylated sugar residues of AMP60N

从图3可以看出,在HPGPC谱图上显示峰形为一对称单峰,说明AMP60N为均一多糖。其保留时间14.487 min,通过以普鲁兰多糖绘制的分子量标准曲线,计算得到AMP60N重均分子量为11200 u。

图3 AMP60N的高效液相凝胶渗透色谱图Fig.3 HPGPC spectrum of AMP60N

2.5 红外光谱分析

将AMP60N采用KBr压片法进行红外光谱分析,结果如图4所示。

图4 AMP60N的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of AMP60N

从图4可以看出,3369 cm-1处的强吸收峰为O-H键的伸缩振动吸收,2937 cm-1处出现多糖的C-H强伸缩振动峰,这两组吸收峰为糖类化合物的特征吸收峰。1024 cm-1处出现吸收峰是由吡喃糖环的C=O伸缩振动造成的,931 cm-1处和601 cm-1处分别是由吡喃环的非对称环伸缩振动和对称伸缩振动产生的吸收峰[13],表明AMP60N主要为吡喃环糖苷连接。

2.6 高碘酸氧化、Smith降解及GC分析

AMP60N在高碘酸氧化过程中,每摩尔糖基消耗高碘酸钠量为1.6176 mol,产生甲酸0.1197 mol,说明AMP60N可能含有1→6位键合的糖基或非还原末端糖基,由于高碘酸消耗量大于2倍的甲酸生成量,说明还可能存在只消耗高碘酸而不生成甲酸的1→2、1→2,6、1→4或1→4,6等连接键型。进一步对AMP60N的Smith降解产物进行气相色谱发现,产物中有甘油生成,说明可能存在产生甘油的键型或1→5连接的戊糖,产物中无赤藓醇,说明不含有1→4和1→4,6键型的己糖。产物中未检测到阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖,说明这三种单糖都是以可被高碘酸氧化的键型存在。

2.7 甲基化分析

AMP60N的甲基化产物经红外光谱分析,羟基吸收峰基本消失,甲基吸收峰有所增强,说明甲基化完全。甲基化样品再通过酸水解、硼氢化钠还原以及乙酰化,得到部分甲基化糖醇乙酸酯(PMAA)产物,对其进行GC-MS分析,根据质谱图和单糖组成,AMP60N的甲基化糖残基、主要质谱碎片(m/z)、保留时间、摩尔比以及连接键型列于表2。

从表2可以看出,薤白中性多糖AMP60N中吡喃葡萄糖以1,2位连接吡喃葡萄糖和1,2,6位连接吡喃葡萄糖方式存在,阿拉伯糖以末端残基和1,5位连接阿拉伯糖的方式存在,而半乳糖1,2,6位连接的半乳糖方式存在。

2.8 核磁共振波谱分析

多糖的1H-NMR主要用来确定多糖结构中糖苷键的构型。但由于糖环碳上大部分质子受羟基的屏蔽作用,使得化学位移集中大部分在3～4 ppm范围内,造成严重的信号重叠交叉,解析困难[14]。图5为AMP60N的13C-NMR谱,可以明显看出,在δ 103～104 ppm范围内出现的4个碳信号,均为β型糖苷异头碳的共振信号;在δ78～85 ppm范围内出现了两个碳信号,表明C-2,C-3或C-4中有碳发生取代。

图5 AMP60N的13C-NMR图谱Fig.5 13C-NMR spectrum of AMP60N

结合上述各种方法可以推断,AMP60N主要由Glc(1→2)和Ara(1→5)构成,以Gal(1→6)和Glc(1→6)为支链,分支点位于Glc(1→2)的C-6处,末端残基为Ara,各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在。

2.9 抗氧化活性

2.9.1 DPPH自由基清除活性 不同浓度的薤白多糖AMP60N清除DPPH自由基的活性测定结果如图6所示。结果表明,中性多糖AMP60N具有一定的DPPH自由基清除能力,且清除率随着浓度增加而升高,在测定范围内呈明显的量效关系。但与VC的清除能力相比较而言,清除能力较弱。

图6 AMP60N清除DPPH自由基的活性Fig.6 Scavenging activity of AMP60N on DPPH·

2.9.2 羟基自由基清除活性 不同浓度的中性多糖AMP60N清除羟基自由基(OH·)的活性测定结果如图7所示。结果发现,AMP60N对于羟基自由基的清除能力具有明显的量效依赖关系。在多糖浓度达6000 μg/mL时,羟基自由基清除率可达38.53%。

图7 AMP60N清除羟基自由基的活性Fig.7 Scavenging activity of AMP60N on OH·

图8 AMP60N清除超氧阴离子自由基的活性

3 结论

通过分步醇沉的方法,从药食两用植物薤白的60%醇沉组分中分离纯化了一种中性多糖AMP60N,AMP60N重均分子量为11200 u,由阿拉伯糖,葡萄糖和半乳糖构成,3种单糖的摩尔比为9.73∶1.10∶1.00,经红外光谱分析,同时结合高碘酸氧化、Smith降解及GC分析等手段,通过甲基化分析,核磁共振波谱分析,初步确定AMP60N的分子结构中存在有以1,2位和1,2,6位连接的葡萄糖,以及1,5位连接的阿拉伯糖和阿拉伯糖末端残基,同时还存在以1,2,6位连接的半乳糖,各糖苷主要以β-吡喃糖形式存在。通过对AMP60N清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的活性实验测定表明,AMP60N具有一定的体外抗氧化活性,且呈现明显的量效关系,但与VC相比较,其抗氧化能力较弱。

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Structural characterization andinvitroantioxidant activities of a neutral polysaccharide fromAlliummacrostemonBunge

ZHANG Zhan-jun1,3,WANG Fu-hua2,GE Hong1,ZHANG Jun1,LI Hai-feng1

(1.Engineering Research Center,Yangzhou Vocational University,Yangzhou 225009,China; 2.Yangzhou Polytechnology Institute,Yangzhou 225127,China; 3.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

By using the method of stepwise ethanol precipitation and column chromatography,a neutral polysaccharide named AMP60N was isolated fromAlliummacrostemonBunge. The molecular weight of AMP60N was estimated to be 11200 u,which was composed of arabinose,glucose and galactose. AMP60N was characterized by using the periodic acid oxidation,Smith degradation,methylation,FT-IR,GC,GC-MS,NMR,etc. Theinvitroantioxidant assay of AMP60N showed that it had certain antioxidant activitiesinvitro,which showed dose-effect relationship,oxidation vesistance was weaker than VC.

AlliummacrostemonBunge;polysaccharide;structural characterization;antioxidant activities

2016-09-22

张占军(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：moutaidc@163.com。

江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20141269)；江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人资助[苏教师(2016)15号]；江苏省第五期“333高层次人才培养工程”资助。

TS201.2

A

1002-0306(2017)08-0077-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.007