槲皮素钙的合成及其生物活性研究

刘秋伟,张会丽,李阳杰,翟广玉，2*

(1.郑州工业应用技术学院 药学院，河南 郑州 451150;2.郑州大学 护理学院，河南 郑州 450052)

槲皮素钙的合成及其生物活性研究

刘秋伟1,张会丽1,李阳杰1,翟广玉1，2*

(1.郑州工业应用技术学院 药学院，河南 郑州 451150;2.郑州大学 护理学院，河南 郑州 450052)

合成了槲皮素钙，观察了其生物活性。将槲皮素与醋酸钙在pH=8.5的条件下加热回流6h，生成了槲皮素钙。分析发现槲皮素钙紫外光谱带Ⅰ和带Ⅱ比槲皮素分别红移了28nm和8nm；槲皮素钙的羰基振动频率υC=O为1647.52cm-1比槲皮素向红移了15.58cm-1，在高场出现了新的吸收峰υM-O=640.64cm-1，说明有金属配位键生成；氢谱中槲皮素钙的3-OH和3'-OH上的氢消失，7-OH，5-OH，4'-OH上的氢依然存在，这说明槲皮素的3位羟基和4位羰基上的氧与钙离子配位，3'和4'位羟基与钙离子结合。用DPPH法测定了槲皮素钙与槲皮素的EC50分别是8.17和14.07mg/L，说明槲皮素钙的清除自由基的能力没有槲皮素强。

槲皮素；槲皮素钙；合成；表征；自由基清除能力

前言

钙是人体必需的营养元素,它能调节人体各系统、组织、器官的正常生理功能,人体中每个细胞的活动,都受钙的制约。骨骼是人体的支架,钙是骨、牙齿的主要成分。骨、牙齿是人体的钙库,它调节人体细胞外液的钙离子浓度，并保持恒定。钙离子是神经和肌肉之间的介质,始终控制着肌肉的起动、舒张过程。钙离子通过改变胞浆内浓度而直接参与神经末梢的传导过程,神经介质的释放、正常肌力的维持都需要钙离子的参加。很多参与细胞代谢的酶活性都需要钙离子激活，如三磷酸腺苷酶、脂肪酶、淀粉酶、腺苷酸环化酶、磷酸二脂酶、色安酸羟化酶等。钙离子在机体凝血过程中起着重要作用，机体缺钙时可能出现出血不止或凝血过度、血液黏稠度过高的症状[1，2]。

槲皮素广泛存在于水果（苹果、草莓）、蔬菜（洋葱、蕃茄）、饮料（茶叶、咖啡、红酒）中[3]，它显示出多方面的生物活性，是天然的抗氧化剂，特别是具有清除体内自由基的性能，保护细胞氧化造成的损伤，能够调整细胞内信号，促进细胞的存活，还具有抗癌、抗炎、抗病毒、降血压，改善肥胖[4～9]等作用。

槲皮素对金属离子具有强烈的螯合作用，可生成稳定的环状化合物。研究发现，槲皮素与不同金属离子形成配合物，其生物活性得到了不同程度的改进[10]。Ferrer等[11]合成了槲皮素钒配合物，研究发现槲皮素钒可以刺激I型骨生长，对磷酸酯酶有抑制作用，它可促进骨细胞的分裂、增殖，具有抗骨癌的作用。Bukhari等[12]合成了槲皮素钴配合物，运用DPPH自由基清除法，研究其体外抗氧化活性，结果表明槲皮素钴配合物清除自由基的活性明显高于槲皮素。周晶等[13]合成了槲皮素铜，研究表明槲皮素铜能够插入DNA的碱基对中，从而影响DNA分子的构型，抑制了DNA分子的进一步复制与转录，最终达到抗癌效果。谭君等[14]发现槲皮素锌和槲皮素镍也能嵌入DNA的碱基对中，使细胞核皱缩，引起细胞凋亡。因此，近年来，对槲皮素金属配合物的研究逐年增多，这对槲皮素的开发利用及寻找新药开辟了新的途径[15]。在我们日常生活中经常食用一些含有槲皮素的黄酮类蔬菜和水果，如蕃茄、洋葱、苹果、柑橘等，可清除体内的自由基，使机体免受自由基的损伤，对降低人体内重金属离子的含量起着重要的作用。

本文介绍了合成槲皮素钙的方法，并对其结构进行了表征，研究了其清除自由基的能力。

图1 槲皮素的结构Fig.1 The structure of quercetin

1 实验

1.1 药品与器材

槲皮素（自制：芦丁酸水解，分离，甲醇纯化），醋酸钙（分析纯），其他试剂均为分析纯。

FTS-3000型红外光谱仪（KBr压片，美国尼高力）；德国耐驰 (Netzsch)STA 409 PC/PG差热分析仪；UV-240型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；400MHz核磁共振仪（德国Brucker）。

1.2 槲皮素钙的制备

按文献[16]的方法适当改进，在三颈烧瓶中，取1mmol（302mg）槲皮素，加入25mL甲醇，搅拌使完全溶解，加入甲醇钠调pH=8.5。加入预先溶于25mL甲醇中的1mmol（111mg）无水醋酸钙溶液。在可加热的磁力搅拌器上加热回流6h。用硅胶G板监控反应进程，待反应完成时停止回流。过滤，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，得棕黄色固体，用甲醇冲洗三次，真空干燥器中干燥，得深棕黄色固体。

槲皮素钙为深棕黄色粉末，溶于甲醇、乙醇、DMSO，微溶于丙酮，乙酸乙酯，不溶于苯、甲苯和四氯化碳。

1.3 清除自由基实验

1×10-4mol/L的DPPH溶液的配制：精密称取10mg DPPH，置于250mL容量瓶中，加入少量无水乙醇，待溶解后再用无水乙醇定容至刻度，混匀，避光，置于冰箱保存。供试液的配制：精密取各样品适量，以乙醇为溶剂，分别配制100mg/L，80mg/L，60mg/L，40mg/L，20mg/L的待测溶液。精确吸取不同浓度的样品溶液1mL，分别与3mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液混合，避光放置30min，在517nm处测吸光度Ay。以相应溶剂代替样品作为空白对照，吸光度为As，相应样品溶液的吸光度为A0。DPPH自由基清除活性按下式计算：

式中Ay—1mL样品溶液与3mL DPPH溶液混匀后的吸光度值；As—1mL乙醇溶液与3mL DPPH溶液混匀后的吸光度值；A0—1mL样品溶液与3mL乙醇溶液混匀后的吸光度值；参考文献[16]计算自由基半数清除率。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱分析

槲皮素在258nm和360nm有两个吸收峰，分别属于n→π*（A环）电子跃迁和π→π*（B环）电子跃迁，分别对应两个生色团组成：258nm吸收带由苯甲酰生色团产生，为带Ⅱ；360nm吸收带由肉桂酰生色团产生，为带Ⅰ[17]。

图2 槲皮素的结构及其紫外光谱特征Fig.2 The structure of quercetin and its UV spectrum signature

槲皮素钙的UV吸收带Ⅱ由258nm红移至266nm，红移8nm；带Ⅰ由360nm红移至388nm，红移28nm。这是由于形成配合物后，共轭体系增大，能量降低，最大吸收向长波方向移动引起的。带Ⅰ红移远远大于带Ⅱ，这说明Ca2+是在带Ⅰ区域内与槲皮素配位形成配合物的[18]。

图3 槲皮素和槲皮素钙的紫外光谱图Fig.3 The UV spectra of quercetin and quercetin calcium

2.2 红外光谱分析

槲皮素分子主要官能团红外吸收归属：υC=O1663.10cm-1；苯环骨架振动频率 υC=C1610.89cm-1，1449.49cm-1；δC3-OH1382.03cm-1；υC-O酚1319.41cm-1；υ-OH3408.74cm-1。

图4 槲皮素的红外光谱Fig.4 The IR spectrum of quercetin

槲皮素钙的红外光谱显示，羰基吸收峰υC=O1663.10cm-1，红移至1647.52cm-1，这是因为羰基形成了配合物引起的。槲皮素的特征吸收峰υ-OH3408.74cm-1，在槲皮素钙中是3405.15cm-1几乎没有发生变化，这说明槲皮素的基本骨架没有发生变化。

图5 槲皮素钙的红外光谱Fig.5 The IR spectrum of quercetin calcium

槲皮素和槲皮素钙的红外图谱特征吸收峰比较结果显示：①槲皮素的υC=O1663.10cm-1羰基振动频率移至1647.52cm-1，向红移了15.58cm-1，可见槲皮素的4-羰基参与了槲皮素钙配合物的形成[19]。②槲皮素钙配合物在640.64cm-1出现了υM-O，说明有金属配位键生成。③苯环骨架振动频率υC=C1610.89cm-1，和υC-O-C1262.46cm-1，分别移至1596.11cm-1和1267.07cm-1，说明在形成配合物后，苯环骨架的存在，只是向红移动了约几个至几十个波数[20]。

表1 槲皮素和槲皮素钙的红外吸收数据比较Table 1 The IR absorption data of quercetin and quercetin calcium

2.3 槲皮素钙的氢谱

1H NMR谱是鉴定黄酮化合物的结构类型、确定取代基的位置和进行结构研究的有效方法。氢谱可以提供有关分子中不同种类氢原子的情况，如根据化学位移和偶合常数可以判断有关氢原子的化学环境，每种不同环境下氢原子的数目以及每个氢原子相邻的基团的结构等。槲皮素和槲皮素钙的氢谱如表2所示。

表2 槲皮素和槲皮素钙的氢谱Table 2 The H-NMR spectrum data of quercetin and quercetin calcium

由上述氢谱数据可知，槲皮素钙中的3-OH和3'-OH上的氢消失，而其它3个羟基（7-OH，5-OH，4'-OH）上的氢依然存在，这说明槲皮素的3位羟基和4位羰基上的氧与钙离子配位，3'和4'位羟基与钙离子结合。这与紫外光谱和红外光谱数据是一致的[21～22]。

根据上述UV、IR、H NMR可得出槲皮素钙的结构：

图6 槲皮素钙的结构Fig.6 The structure of quercetin calcium

2.4 槲皮素钙清除DPPH自由基的作用

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液在517nm处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时，由于DPPH自由基的单电子被配对，从而使得在517nm处的吸光度减小，因此该法常被用来评价样品的抗氧化能力[23～24]。

图7 槲皮素和槲皮素钙对DPPH自由基的清除作用Fig.7 The DPPH free radical scavenging capacity of quercetin and quercetin calcium

从图7可见，槲皮素和槲皮素钙都随着浓度的增大，对DPPH自由基的清除率也增大，但是很明显槲皮素与钙离子形成配合物后，其对DPPH自由基的清除能力略有降低。根据实验结果，槲皮素钙与槲皮素的EC50分别是8.17和14.07mg/L，进一步说明槲皮素在与钙配位后，其清除DPPH自由基能力降低，这可能是形成配合物后，邻二酚结构的羟基与钙离子配位，使其接受质子的能力降低引起的。

3 结论

槲皮素与醋酸钙在碱性条件下，生成了槲皮素钙配合物。通过紫外、红外、核磁等手段对槲皮素钙进行了结构表征。光谱数据阐明了配位的位点：槲皮素的3位羟基和4位羰基上的氧与钙离子配位，3'和4'位羟基与钙离子结合。通过DPPH法测定了槲皮素钙清除自由基的能力。实验结果显示，槲皮素钙清除自由基的能力没有槲皮素强。

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Synthesis and Biological Activity of Quercetin Calcium Complexes

LIU Qiu-wei1,ZHANG Hui-li1,LI Yang-jie1and ZHAI Guang-yu1,2
（1.College of Pharmacy,Zhengzhou University of Industrial Technology,Zhengzhou 451150,Chnia;2.College of Nursing,Zhengzhou University, Zhengzhou 450052,China）

The quercetin calcium is synthesized and its bioactivity is observed.The quercetin and acetate calcium are heated and refluxed for 6 hours at pH=8.5 to form quercetin calcium.The UV spectrum bandⅠandⅡof quercetin calcium has a red shifted by 28nm and 8nm respectively compared with that of quercetin;the carbonyl vibration frequency of quercetin calcium was 1647.52cm-1,which shifts to red about 15.58cm-1than that of quercetin,the new absorption peak υM-O=640.64cm-1appears in the high field,which indicates that there is a formation of metal coordination bond; the hydrogen spectrum of quercetin calcium shows that the 3-OH and 3'-OH hydrogen disappears,but the 7-OH,5-OH and 4'-OH still exists, which indicates that the oxygen at the 3-hydroxyl and 4-carbonyl groups of quercetin coordinates with the calcium ion and the hydroxyl groups at the 3'and 4'position combines with calcium ion.The free radical scavenging capacity of quercetin calcium and quercetin is measured by DPPH method, and their EC50are 8.17 and 14.07mg/L respectively,and this means the free radical scavenging capacity of quercetin calcium is worse than that of quercetin.

Quercetin;quercetin calcium complexes;synthesis;characterization;free radical scavenging capacity

TQ460.32

A

1001-0017（2017）01-0025-05

2016-08-01

刘秋伟（1984-），女，河南平顶山人，讲师，从事天然产物有效成分的提取及教学工作。

*通讯联系人：翟广玉（1954-），男，河南项城人，教授，硕士生导师，从事中草药有效成分的结构优化、药物化学合成及教学工作。

E-mail:Zhaiguangyu1@sina.com。