钙调蛋白N2和C2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

晏珊，雷帅，陈思充，于佳慧，祝旭东，孙嘉瑶，杜逸，李墨，唐子鉴，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122）

钙调蛋白N2和C2突变体载体的构建、表达纯化和鉴定

晏珊，雷帅，陈思充，于佳慧，祝旭东，孙嘉瑶，杜逸，李墨，唐子鉴，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理学教研室，沈阳110122）

目的构建钙调蛋白（CaM）N2和C2突变体的表达性载体，表达纯化并进行活性鉴定，为进一步研究CaM与钙通道片段的相互作用奠定基础。方法将CaM的N-lobe和C-lobe的cDNA分别与相应的N-lobe和C-lobe的cDNA相连，制备N2和C2突变体的cDNA。将N2和C2的cDNA分别插入pGEX-6p-3载体，并将重组质粒转入E.coliBL21菌株，IPTG诱导转化成功的菌株表达GST融合蛋白，超声破碎法提取，GS-4B beads纯化，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白相对分子质量及纯度，pull-down实验鉴定活性。结果酶切鉴定以及DNA测序结果证实重组质粒构建成功；SDS-PAGE电泳图显示突变体蛋白纯度和浓度均较高；pulldown实验结果证明突变体蛋白有生理活性，能与钙通道片段结合。结论本研究成功构建了N2和C2表达质粒，并提取、纯化了有活性的钙调蛋白N2和C2突变体。

钙调蛋白；N-lobe；C-lobe；N2；C2；pull-down实验

钙调蛋白（calmodulin，CaM）是一种广泛存在于生物体内的Ca2+感受器，参与细胞的多种生理过程，如突触可塑性、肌肉收缩、细胞周期的调控、生物周期节律的调节等，尤其在Ca2+参与的信号通道的调节中更具有重要作用。

CaM是由2个高度同源的球型区域，即C-lobe和N-lobe，以及2个lobe之间呈α-螺旋的连接肽段组成，整体的空间结构呈哑铃状［1-2］。每个lobe都包含2个Ca2+结合位点（又称EF-hand），而每个EF-hand结构均能结合1个Ca2+，但C-lobe和N-lobe的Ca2+结合能力却有一定的差异［3］，有研究［4］表明，C-lobe与Ca2+的亲和力较N-lobe高。……