miR-517a-3p对人肺鳞癌细胞生长和转移的影响及分子机制

时昌立 秦德华 丁广成 李朋朋 田 碧

(郑州大学第五附属医院肿瘤治疗中心，河南 郑州 450052)

miR-517a-3p对人肺鳞癌细胞生长和转移的影响及分子机制

时昌立 秦德华 丁广成 李朋朋 田 碧

(郑州大学第五附属医院肿瘤治疗中心，河南 郑州 450052)

目的 探讨miR-517a-3p对人肺鳞癌细胞生长和转移的影响及分子机制。方法 肺鳞癌细胞株H460培养24 h后用Lipofectamine 2000转染试剂转染，分为miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组，并设空白对照组。CCK8检测3组细胞的增殖情况；Transwell检测细胞的侵袭能力；Western印迹检测细胞中侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达水平。构建e2f6-3′Utr区的双荧光素酶报告载体，检测miR-517a-3p对下游靶基因e2f6的调控作用。结果 CCK8检测显示，miR-517a-3p过表达组细胞增殖速度较空白对照组明显降低，miR-517a-3p 表达抑制组增殖率明显提升(P<0.05)。miR-517a-3p 过表达组H460穿膜数明显低于空白对照组；miR-517a-3p 表达抑制组穿膜数明显高于空白对照组(P<0.05)。miR-517a-3p 过表达组MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量均明显低于空白对照组，miR-517a-3p 表达抑制组明显高于空白对照组(P<0.05)。过表达miR-517a-3p可明显下调e2f6-3′Utr的报告载体荧光素酶活性，抑制miR-517a-3p表达后可上调荧光素酶活性，与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。过表达miR-517a-3p后e2f6的表达量明显低于空白对照组；抑制miR-517a-3p表达后，e2f6的表达量明显高于空白对照组(P<0.05)。结论 miR-517a-3p可通过调控下游靶基因e2f6而抑制肺鳞癌细胞株H460的生长和侵袭力。

miR-517a-3p；肺鳞癌

肺鳞癌约占肺癌总数的40%，且多为老年患者，发病率近10年呈快速增长趋势〔1〕。miRNA在真核生物细胞活动及多种肿瘤发展中具有调控作用〔2〕。相关研究显示，miR-517a-3p可通过靶向作用于Wee1基因抑制肾癌细胞迁徙和侵袭力〔3〕，提示具有抑癌基因的作用。目前，miR-517a-3p对人肺鳞癌细胞的作用鲜有报道。本研究旨在探讨miR-517a-3p对人肺鳞癌细胞株H460生长和转移的影响及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 H460购于南京森贝伽生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、optimem培养基购于上海索莱宝生物科技有限公司；基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗体、miR-517a-3p minics、miR-517a-3p inhibitor购于广州市锐博生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒、PCR扩增引物购于上海信裕生物技术有限公司；Transwell培养板、胆囊收缩素8(CCK8)试剂、双荧光素酶检测试剂盒购于威格拉斯生物技术(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 H460放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，放入CO2孵箱中培养过夜。取对数期细胞，按1×106个/孔接种到6孔板中，培养24 h后用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染，分为miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组，并设空白对照组。

1.2.2 实时定量RT-PCR和CCK8检测 转染48 h后Trizol法提取H460细胞总RNA，逆转录得到cDNA，行RT-PCR反应，反应体系30 μl，反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；60℃ 30 s，共进行40个循环。CCK8检测：将转染48 h的细胞培养基弃去，按1∶1比例每孔加入200 μl的DMEM培养基，37℃ CO2培养箱中孵育2 h，读取495 nm处的吸光度值。

1.2.3 Transwell检测细胞侵袭力 将铺有基质胶的Transwell培养板37℃预热，消化细胞用无血清的DMEM培养基冲洗，细胞密度调整为1×106个/孔，接种到上室，300 μl/孔；下室中加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，孵育24 h，取出Transwell培养板，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，4%甲醛溶液固定20 min，结晶紫染色后显微镜下观察、计数。

1.2.4 Western印迹检测 取对数期H460细胞，1×106个/孔密度接种到培养皿中，分别转染miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组，48 h后裂解细胞提取总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，湿法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭3 h，滴加一抗，4℃环境下孵育过夜，PBS洗涤后滴加二抗，室温下孵育3 h，化学发光法显示，凝胶系统采集图像。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测 构建MriGlo/e2f6-3′Utr和PmirGlo/e2f6-3′Utr mut报告载体，使用基因转染试剂分别与miR-517a-3p 过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组、空白对照组共转染到H460细胞中，培养48 h后裂解细胞，检测荧光素酶活性，分别记为实验组(A1)、荧光素酶表达载体(A2)，计算A1/A2为相对荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 miR-517a-3p对肺癌细胞株H460增殖能力的影响 miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p表达抑制组中miR-517a-3p表达量分别为(13.61±2.35)、(2.39±0.52)，与空白对照组(7.19±1.07)比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示转染成功。CCK8法检测细胞增殖情况显示，miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组、空白对照组吸光度值分别为(47.36±8.02)、(162.39±25.61)、(105.18±11.89)，miR-517a-3p过表达组细胞增殖速度较空白对照组明显降低，miR-517a-3p 表达抑制组增殖率明显提升(P<0.05)。

2.2 miR-517a-3p对H460侵袭力的影响 miR-517a-3p 过表达组H460穿膜数为(46.68±7.35)，明显低于空白对照组的(118.50±13.28)；miR-517a-3p 表达抑制组为(143.92±15.30)，明显高于空白对照组(P<0.05)。见图1。

图1 Transwell检测miR-517a-3p对H460 侵袭力的影响(×200)

2.3 miR-517a-3p对H460侵袭相关蛋白表达的影响 miR-517a-3p过表达组、miR-517a-3p表达抑制组、空白对照组MMP-2蛋白相对表达量分别为(4.369±0.525)、(10.284±1.136)、(7.390±0.954)；MMP-9蛋白相对表达量分别为(2.920±0.374)、(7.367±0.952)、(5.312±0.628)。miR-517a-3p 过表达组MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量均明显低于空白对照组，miR-517a-3p 表达抑制组明显高于空白对照组(P<0.05)。见图2。

图2 miR-517a-3p对H460细胞MMP-2和 MMP-9蛋白表达影响

2.4 miR-517a-3p对e2f6靶序列的作用 miR-517a-3p 过表达组、miR-517a-3p 表达抑制组、空白对照组野生型e2f6-3′Utr的报告载体荧光素酶活性分别为(0.541±0.036)、(1.695±0.428)、(1.059±0.495)。过表达miR-517a-3p可明显下调e2f6-3′Utr的报告载体荧光素酶活性，抑制miR-517a-3p表达后可上调荧光素酶活性，与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5 miR-517a-3p调控H460细胞中e2f6的表达情况 空白对照组H460细胞中e2f6的表达量为(4.914±0.751)，过表达miR-517a-3p后e2f6的表达量为(1.957±0.136)，明显低于空白对照组；抑制miR-517a-3p表达后，e2f6的表达量为(7.602±0.665)，明显高于空白对照组(P<0.05)。见图3。

图3 miR-517a-3p调控H460细胞中e2f6的表达

3 讨 论

miRNA与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关，且多定位在基因组中癌症相关的位点，近年来多项相关研究证实miRNA异常表达与肺鳞状上皮细胞癌有明显关联，如miR138可通过影响PDK信号通路来抑制肺鳞癌细胞的增殖、分化〔4〕；miR143、miR21的表达水平与肺鳞状上皮细胞癌患者病理特征和治疗预后明显相关〔5〕。相关研究发现，miR-517a-3p在多种恶性肿瘤组织中存在异常表达，且发挥不同作用，如miR-517a-3p可通过降低细胞周期检测点激酶(CHK)1表达水平可抑制宫颈癌的发生、发展，有效预测宫颈癌的治疗预后〔6〕；miR-517a-3p还与前列腺癌、胰腺癌等多种癌细胞侵袭有关〔7〕。

本研究说明肺鳞癌组织中miR-517a-3p发挥抑癌基因的作用；同时细胞侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的相对表达量均明显降低，进一步说明过表达miR-517a-3p可有效抑制人肺鳞癌细胞的侵袭力。相关研究显示，e2f6可有效抑制DNA功能缺损导致的细胞凋亡，其在宫颈鳞癌组织中表达下调，可能与宫颈癌发生和进展有关〔8〕。本次研究显示，miR-517a-3p的表达与e2f6呈负相关，进一步对e2f6蛋白表达检测显示，miR-517a-3p负向调控人肺鳞癌细胞中的e2f6蛋白表达，其具体功能和机制仍需进一步深入研究。

1 田 文，高敬华，李永生，等.紫杉醇脂质体单药与紫杉醇脂质体联合顺铂治疗老年中晚期肺鳞癌的疗效比较〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(8)：2076-7.

2 吴建军.NNK诱导肺癌发生过程中循环microRNA标志物研究〔D〕.广州：南方医科大学，2013.

3 李欲哲，高艳丽，孙 崴.香坊区2014年恶性肿瘤发病与死亡分析报告〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(3)：298-300.

4 陈 旭，王 琳，蒋 敏，等.肺癌患者血清和单个核细胞9种miRNAs表达差异及其意义〔J〕.中华检验医学杂志，2013；36(2)：165-72.

5 唐夏莉，焦德敏，陈 君，等.miRNA-126对肺癌 A549细胞的增殖、迁移、侵袭及 EGFR/AKT/mTOR 信号通路的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2016；32(3)：458-63.

6 顾泽鑫，赵微微.肺鳞癌术后组织中转移相关蛋白2、上皮型黏附素和组织蛋白酶K表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(18)：5194-5.

7 李海洋，赵振山.肺癌患者放疗前后外周血淋巴细胞亚群变化研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(2):213-6.

8 卢韶华.肺癌患者组织及血浆miRNA肿瘤标记物的发现及验证〔D〕.上海：复旦大学，2010.

〔2016-11-22修回〕

(编辑 袁左鸣)

时昌立(1985-)，男，在读硕士，医师，主要从事肿瘤治疗研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2132-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.021