不同处理对桃形李采后病原菌防治效果

何莹蓉 林海雁 曹宗威 胡巧萍 李银平 胡会刚 莫亿伟

摘 要 桃形李采后極易发生病害，难以保鲜，为了控制桃形李采后病害的发生，通过对分离到的病原菌扩展青霉菌株（Penicillium expansum，TXL-01）进行形态学观察和对其它水果致病性试验，分别用硝普钠、葡萄籽提取物和NaHCO3在PDA培养基上进行抑菌实验。结果表明：形态学观察发现致病菌菌丝有分枝和横隔膜，具帚形孢子囊，能产生大小不同的2种类型孢子；对多种水果侵染后均能致病，说明致病菌对宿主要求专一性不高；硝普钠和葡萄籽提取物只能在前3 d抑制病原菌的生长，但是在第4 天以后与对照无明显差异；NaHCO3浓度为0.10%和0.15%时，培养到第6天时能显著抑制病原菌生长；当NaHCO3为0.2%时，培养到第12天时内还能抑制病原菌生长；再分别以0.10%、0.15%、0.20% NaHCO3和0.20% NaHCO3+1.0%壳聚糖（Chitosan）复合处理桃形李采后果实，发现0.20% NaHCO3处理虽然也能减少果实腐烂率，但结合1.0% Chitosan涂膜处理对果实保鲜效果更好，可以显著抑制致病菌的发生，降低果实发病率，说明NaHCO3和Chitosan复合处理可以应用于桃形李的采后保鲜。

关键词 桃形李；扩展青霉；碳酸氢钠；硝普钠；抑菌试验

中图分类号 S667.3 文献标识码 A

Abstract Shengzhou Nane can easily accelerate the process of water loss， softening， microbial attacking and decay of fruits during post-harvest storage. The shelf life of fresh fruit is very short， and the fruit can deteriorate within a few days under ambient temperature. In order to control the fruit disease in harvested period， studies were conducted on the morphology of the isolated pathogen from fruit and its host range to other fruits. Three substances including nitroprusside， grape seed extract， and sodium bicarbonate were used on antibacterial tests. In addition， sodium bicarbonate in combination with 1.0% chitosan was used as the preservation treatment in Shengzhou Nane. Morphological observation showed that the pathogen had diaphragm and broom-shaped sporangia branches and could produce two kinds of spore in different sizes. A variety of infected fruits revealed that the requirement for the pathogens host range specificity was not so high. Nitroprusside and grape seed extract could inhibit the growth of the pathogen for the former 3 days， while there was no significant difference between the treatment and control after 4 days. Sodium bicarbonate with concentration of 0.10%， 0.15% could remarkably inhibit the growth of the pathogen for 6 days cultivation， and the inhibition lasted 12 days and with concentration of 0.20%， In addition， 0.20% sodium bicarbonate combined with 1.0% Chitosan was used for postharvest plum could remarkably reduce the decay rate of fruits， indicating a better effect. Thus， the combinational treatment could significantly inhibit the occurrence of the pathogen and reduce morbidity in the fruit. As a result， an improvement in storability and thus prolonged storage time were achieved for Shenzhou Nane fruits during post-harvest period.

Key words Shengzhou Nane； Penicillium expansum； sodium bicarbonate； nitroprusside； antibacterial test

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.023

嵊州桃形李果实心形，味甜且香气较浓，汁液丰富酸甜可口，可食率达97.8%，成熟于7月中旬，正值产地高温多雨季节。高温条件下，桃形李果实采后呼吸旺盛迅速软化而易受多种病原菌侵染。项目组前期对嵊州桃形李采后保鲜研究发现，常温条件下果实难以保鲜，极易发生病害，但若贮藏温度过低则易出现冷害现象，冷害后果皮和果肉均发生褐化变色失去食用价值，因此桃形李采后病害防治和保鲜技术还需深入研究。水果采后保鲜通常有物理、化学、单一或复合涂膜保鲜法等[1-2]，其中化学杀菌剂对水果采后病原菌防治相对较好，但若频繁使用则引起病原菌产生抗药性和农药残留超标等问题[3]，随着公众对农药杀菌剂残毒日益关注，化学杀菌剂应用范围已受到了不少限制[4]，因此安全有效的采后病害防控技术显得更价值。葡萄籽提取物具有强烈抑菌和抗氧化作用，如经葡萄籽提取物处理后能显著抑制鸭梨黑斑病和青霉病的发生[5]，还能降低桃果实贮藏期的腐烂率和减轻果肉褐变系数[6]；同时壳聚糖在果蔬保鲜方面已有广泛的应用并取得良好的效果[7-8]，并有显著抑菌效果[9-10]。但葡萄籽提取物和壳聚糖应用在桃形李采后保鲜方面则少有报道。

硝普钠作为一種新型保鲜剂，通常被用作NO供体，用硝普钠溶液浸泡果实比直接用NO处理所需无氧条件下处理更为有效，目前已应用于菠菜、芦笋、香蕉等蔬果的保鲜[11-13]；而碳酸氢钠（NaHCO3）被公认为是一种安全、价格低廉的化学物质，在食品工业有着广泛应用，NaHCO3能够抑制多种果实病原真菌的生长，抑制采后病害的发生，增强果实对病原菌侵染的抗性[14-15]，潘寒姁等[16]研究也发现，NaHCO3和抗坏血酸复合处理还能有效地抑制苹果切片的褐变，并能控制微生物污染。但硝普钠和NaHCO3这2种药剂在应用于桃形李采后保鲜也未见相关的报道。本文以前期实验中从桃形李果实中分离到的主要致病菌扩展青霉菌（Penicillium expansum）为材料，重点探讨其致病能力及其无公害的防治方式，为其采后保鲜提供新的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

碳酸氢钠（NaHCO3，分析纯）和硝普钠（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O，分析纯），葡萄籽提取物（宝鸡润木农业开发有限公司，纯度95%），致病菌扩展青霉菌（Penicillium expansum，TXL-01）（本实验室从病果上分离纯化后，经分子生物学和形态学鉴定的菌种）。

1.2 方法

对病原菌按常规的方法培养后，观察在PDA培养基上培养4 d菌落形态，再用光学显微镜观察菌丝及孢子形态。参考朱迎迎等[17]的刺伤接种法鉴定病原菌对不同品种水果的致病性，每种处理接种3个果实，以接种蒸馏水为对照，保鲜袋封口后，置于（30+1）℃，相对湿度为85%～90%的人工气候箱内贮藏，第2～3天后开始统计果实发病情况，以果实表面明显看到菌斑的扩大为发病，计算发病率。

不同试剂对病原菌的抑菌效果试验，在前期实验的基础上，分别将0.2%硝普钠、0.2%葡萄籽提取物和不同浓度的NaHCO3（0、0.15%、0.20%）加入PDA培养基中，再分别接种1 mL 105个/mL菌液，然后置于（30+1）℃的培养箱内，从第3天开始观察培养基上病原菌生长及菌落大小，一直观察到第14天。

嵊州桃形李（Shengzhou Nane）从浙江省嵊州市金庭镇华堂桃形李合作社果园采收后，挑选大小一致、色泽相当，无病虫害约8～9成成熟果实，在18 ℃条件下运回实验室。分别用0、0.10%、0.15%、0.20% NaHCO3及0.20% NaHCO3+1.0%水溶性壳聚糖（Chitosan）浸泡果实5 min后取出，每种浓度处理30个果实，4次重复，共处理120个果实，并在18 ℃空调房内晾干表面水分后，用保鲜袋包装后贮藏于相对湿度为80%～85%，模拟室外环境温度（29+1）℃人工气候箱内贮藏，在贮藏第9天后统计果实发病情况，以出现明显病斑计为发病果，统计发病果占总果数百分率。果实发病率=发病果数/总果数×100%。

1.3 数据分析与处理

数据采用SPSS14.0软件进行方差分析，并利用Duncan多重比较，进行差异显著性分析，p<0.05表示。

2 结果与分析

2.1 桃形李采后主要病害的症状和病原菌的形态特征

桃形李采后病害症状和病原菌形态特征见图1。由图1可知，桃形李果实采后贮藏过程中很快出现病害症状，果实表面呈现不规则果皮开裂情况，同时出现明显的水渍状病斑，病斑部位有白色或灰色绒状物，随后病斑扩大与其他病斑愈合形成更大病斑（图1-a）。通过分离纯化致病菌后经显微镜观察，发现菌丝体有横隔膜，并能进行分枝状生长（图1-b），同时具有帚形孢子囊（图1-c），能产生大小不同的2种类型孢子（图1-c，d），经过前期的分子鉴定，确定为扩展青霉菌（Penicillium expansum，TXL-01菌株）。

2.2 桃形李采后病原菌对其他水果的侵染力分析

为探讨病原菌对不同水果的寄主适应性，分别对梨、苹果、油桃、香瓜、圣女果、葡萄、香蕉、芒果、黄瓜和火龙果等进行刺伤法接种实验，发现香蕉、芒果、香瓜、圣女果、葡萄和苹果都能诱导致病，说明病原菌对寄主要求的专一性不高，具有广谱性特点，但可能是由于不同水果所含养分不同，在接种相同剂量的菌液后，不同水果上表现出的生长速率因品种不同而各异。其中对梨、苹果和油桃接种后这3种果实出现病症最快，接种后第3天就明显看到接种的部位发生明显病斑，而圣女果和葡萄在第4天就明显出现病症，香瓜、香蕉、芒果则在第5天后才能出现明显病症。但黄瓜和火龙果在接种7～10 d内都没有致病，说明这种致病菌不适宜在这2种水果上生长，因而无法诱导这2种水果产生病害，其原因还须深入研究。

2.3 不同浓度药剂处理对菌落生长的影响

不同药剂处理对菌落生长的影响图2。由图2可知，在PDA培养基上加入不同浓度药剂后，菌落的生长速率也不同。其中0.20%硝普钠和葡萄籽提取物在培养前3 d有一定的抑菌效果，但第4天菌落开始恢复生长（图2-a、b），到培养的第6天后，与对照完全没有差异。说明硝普钠和葡萄籽提取物对桃形李致病菌没有抑菌效果，因此在生产上不宜应用。

在PDA培养基中分别加入0.10%、0.15%和0.20% NaHCO3后，在处理的前6 d，所有菌落都不能生长。但在第8天后，在0.10%和0.15%也出现部分菌落的生长；而加入0.20% NaHCO3的培养基培养到第9天时也没有发现新的菌落产生（图2-e），但在培养到第12天后，散落孢子萌发形成的菌落开始生长，到第14天则大量生长（图2-f），说明NaHCO3能显著抑制桃形李病原菌的生长，因此可以在生产上应用。

2.4 不同浓度NaHCO3及与壳聚糖复合处理对桃形李采后腐烂的防病效果

与对照处理相比，不同浓度NaHCO3处理后，果实采后贮藏过程中腐烂率均明显低于对照。从图3可知，采后果实经0、0.10%、0.15%和0.20%NaHCO3溶液浸泡处理后，果实腐烂率分别为43.14%、38.86%、31.14%和23.45%，除了0.10%处理与对照没有顯著差异外，其它2个浓度处理均显著低于对照处理（p<0.05）。若在0.20% NaHCO3基础上再加入1.0% Chitosan复合处理后，果实腐烂率仅为17.96%，更显著低于对照处理的果实腐烂率（p<0.05），说明NaHCO3处理在采后贮藏过程中能显著抑制桃形李果实表面病原菌的生长；若同时加以Chitosan涂膜处理后，在果实表面就形成一个保护膜，进一步减少果实表面的失水率，对维持果实硬度也有明显的促进作用，并且壳聚糖形成保护膜也减少了病原菌对果实侵染，使得果实发病率更低，因此这种复合处理技术可在桃形李采后保鲜应用。

3 讨论

3.1 病原对宿主的要求具有广谱性

本研究表明，从桃形李果实上分离到扩展青霉菌菌株能引起多种水果发生病害，说明这种病菌对宿主要求不高，具有广谱性致病特点。如对苹果和梨接种后，在第2天就出现明显病害症状，可能这一类果实所含养分适宜病原菌生长，同时这个菌株对梨、苹果、葡萄、油桃、樱桃、杏等果实有诱导致病作用。因此，生产上和贮运期间应注意防止病原菌交叉感染，这与欧李褐腐病的病原菌相似[18]。但试验也发现，对黄瓜和火龙果接种病原菌后，在10 d内均不能诱导这2种果实发病，说明该病原菌对宿主有选择性，其原因可能与不同品种果实所含养分不同或是病原菌所需要生长条件有关，具体原因有待于深入研究。

3.2 不同药剂的作用效果

前人对植物提取物抑菌试验已有不少研究，如香茅精油对樱桃番茄灰葡萄孢菌和链格孢菌具有很好抑菌作用[19-20]，而黄柏和金银花正丁醇组分则对杨树溃疡病菌生长均有显著抑制作用[21]。而葡萄籽提取物含丰富的多酚混合物，是一种高效天然抗氧化剂物质[22]，如杨晶琪等[23]发现葡萄籽提取物对鸭梨黑斑病和青霉病均有抑制作用。本试验发现，在PDA培养基内葡萄籽提取物仅在培养前3 d对桃形李原菌有抑制作用，在培养第4天后，与对照已无明显差异，可能随着培养时间延长就无法抑制病原菌生长。这与前人发现土槿皮、高良姜、黄柏、丁香和蒲公英等提取物对柑桔青绿霉菌有较好抑菌效果不同[24]，因此葡萄籽提取物对桃形李的扩展青霉菌这一菌株没有抑制作用。当在PDA培养基中加入NO生成剂硝普钠后，也只在前4 d在对病原菌具有一定的抑制效果，而在第5天后则与对照没有差异，本研究结果与前人发现硝普钠处理能抑制火龙果采后病害的结果不一致[25]，可能由于不同的病原菌对相同药剂的敏感性差异有关。基于本研究结果，葡萄籽提取物和硝普钠均不适宜作为桃形李采后扩展青霉菌的抑菌药剂。

3.3 碳酸氢钠和壳聚糖复合处理抑制果实病原菌生长可能作用机制

本研究发现，在PDA培养基上加入适量浓度NaHCO3能显著抑制病原菌生长，但培养时间超过12 d时，菌丝部分恢复生长，说明在一定时期内NaHCO3处理有效；经不同NaHCO3处理采后果实，发病率也明显低于对照，这与前人用2% NaHCO3结合酵母拮抗菌提高蟠桃采后抗病能力结果类似[26]，但使用浓度有所不同，可能是不同水果所需适宜的浓度差异有关。究其NaHCO3处理降低果实发病率的原因，一是改变培养基pH值所致，如唐静等[27]发现，当培养基加入NaHCO3浓度为8.0 g/L时（对应pH值7.71），对菌丝生长抑制率达79.68%，若用NaOH溶液将培养基pH值提高到10.0时，抑制率反而降低为40.58%，说明NaHCO3抑制菌丝生长不仅仅是pH改变所致；另有可能是CO32-和HCO3-也能抑制菌丝生长，如采用Na2CO3调节培养基pH值至10.0，对杨树溃疡病菌丝生长抑制率接近100.0%，所以推测Na2CO3或NaHCO3这2种药剂对菌丝生长有抑制作用，如Na2CO3能控制Penicillium digitatum引起柑橘绿霉病和由Penicillium

italicum引起柑橘青霉病[28]，而电解碳酸氢钠（eNaHCO3）则能抑制Penicillium digitatum的萌发和生长，并能降低柑橘采后发病率，提高采后保鲜效果[29]，这可能与青霉素合成相关基因表达受到抑制，同时抑制孢子萌发、菌丝生长及分生孢子形成有关[30-31]，因此适宜浓度NaHCO3可控制桃形李采后由扩展青霉菌引起病害的发生。本研究发现，虽然0.20% NaHCO3能在培养基上抑制扩展青霉菌生长，但在采后用0.20% NaHCO3处理后短期内能降低果实腐烂率，若贮藏时间过长则腐烂率又增加，将来在使用浓度上可能还需增加一定剂量，才能更好地抑制病害发生。而经NaHCO3和CTS复合处理能抑制桃形李采后病害发生，一方面NaHCO3能抑制病原菌生长，同时CTS涂膜后，在果实表面形成半透膜，不但能降低果实呼吸速率，防止果实过度失水和提高果实硬度。此外，CTS对病原菌有抑菌作用，能防止环境中其他有害微生物侵染，这与前人报道经CTS处理后对不同水果的青霉菌均有抑制效果类似[9-10，32]。因此，桃形李果实经NaHCO3和CTS复合处理后能降低果实病害提高保鲜效果，此项技术可为桃形李采后扩展青霉菌的防治提供了新思路。

参考文献

[1] 陈 浩， 高 鹏， 高 雅， 等. 辐照降解壳聚糖涂膜对沙糖桔、 圣女果和金桔的保鲜作用[J]. 核农学报， 2008， 22（5）： 640-644.

[2] 刘锴栋， 敬国兴， 袁长春， 等. 外源抗坏血酸对圣女果采后生理和抗氧化活性的影响[J]. 热带作物学报， 2012， 33（10）： 1 851-1 855.

[3] 范 青. 果实采后病害生物防治及其机理研究[D]. 北京： 中国科学院研究生院（植物研究所）， 2001.

[4] 赵亚婷， 朱 璇， 马 玄. 采前水杨酸处理对杏果实抗病性及苯丙烷代谢的诱导[J]. 食品科学， 2015， 36（2）： 216-220.

[5] 杨晶琪， 崔 旸， 曹建康， 等. 葡萄籽提取物对鸭梨果实黑斑病和青霉病的抑制作用[J]. 食品科技， 2010， 35（7）： 200-203.

[6] 高海艳， 李 健. 葡萄籽提取物处理对桃果实采后贮藏品质的影响[J]. 食品研究与开发， 2013， 34（17）： 121-124.

[7] Sun D， Liang G， Xie J， et al. Improved preservation effects of litchi fruit by combining chitosan coating with ascorbic acid treatment during postharvest storage[J]. African Journal of Biotechnology， 2010， 9（22）： 3 272-3 279.

[8] 耿红兰， 刘亚平， 王晓闻， 等. 壳聚糖涂膜处理对冷藏砂糖橘冷害和品质影响[J]. 核农学报， 2016， 30（10）： 1 952-1 958.

[9] 赵进成， 后家衡， 杨宝峰， 等. 壳聚糖对8种植物病原真菌的抑制活性探讨[J]. 浙江农业学报， 2007， 19（6）： 449-453.

[10] 马增新， 杨玲玉， 孟祥红. 壳聚糖和壳寡糖对四种青霉病菌生长和病害控制的比較研究[J]. 食品科学， 2011， 32（增刊）： 72-77.

[11] 周春丽， 吕玲琴， 钟贤武， 等. 硝普钠（SNP）对菠菜保鲜效果的影响[J]. 食品研究与开发， 2012， 33（2）： 184-187.

[12] 李鹏霞， 胡花丽， 王毓宁. 外源NO对采后绿芦笋木质化和抗氧化能力的影响[J]. 农业工程学报， 2012， 28（9）： 264-269.

[13] 张 琦， 刘 千， 张 智， 等. 硝普钠对香蕉采后品质及生理指标的影响[J]. 南方农业学报， 2016， 47（7）： 1 198-1 202.

[14] 习 柳， 田世平.酵母拮抗菌与碳酸氢钠配合对番茄果实采后病害的防治效果研究[J]. 中国农业科学， 2005， 38（5）： 950-955.

[15] Youssef K， Sanzani S， Ligorio A， et al. Sodium carbonate and bicarbonate treatments induce resistance to postharvest green mould on citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology， 2014， 87（2）： 61-69.

[16] 潘寒姁， 谢 芳， 王 姣， 等. 碳酸氢钠与抗坏血酸复合处理对鲜切苹果褐变和品质的影响[J].中国农业大学学报， 2015， 20（2）： 114-123.

[17] 朱迎迎， 高兆银， 李 敏， 等. 火龙果镰刀菌果腐病病原菌鉴定及生物学特性研究[J]. 热带作物学报， 2016， 37（1）： 164-171.

[18] 郝晓娟， 高 莹， 李新凤， 等. 欧李褐腐病病原菌生物学特性及其寄主范围[J]. 果树学报， 2014， 31（1）： 101-104.

[19] 陈倩茹， 徐仕翔， 余 挺， 等. 香茅精油体外和体内对樱桃番茄致病菌灰葡萄孢的抑制性研究[J]. 中国食品学报， 2014， 14（10）： 49-54.

[20] 肖新生， 胡绍文， 周 洁. 油茶饼提取物对圣女果保鲜作用的研究[J]. 食品工业科技， 2011， 32（11）： 141-143.

[21] 唐 静， 周立刚， 曹晓冬， 等. 植物提取物、碳酸钠和碳酸氢钠室内对杨树溃疡病菌生长的抑制作用[J]. 植物病理学报， 2006， 36（5）： 446-453.

[22] 吴 宁， 金 城， 黄 菊， 等. 葡萄籽提取物对香菇保鲜效果的影响[J]. 食品科学， 2013， 34（8）： 299-302.

[23] 杨晶琪， 崔 旸， 曹建康， 等. 葡萄籽提取物对鸭梨果实黑斑病和青霉病的抑制作用[J]. 食品科技， 2010， 35（7）： 200-203.

[24] 付雯， 高永祥， 刘伟伟. 12种中草药提取物对采后柑桔青绿霉菌的抑菌作用[J]. 贵州农业科学， 2015， 43（9）： 170-173.

[25] 汪 莹， 张 弦， 周佳一， 等. 五种抑菌物质对采后病原菌根霉菌生长发育的影响[J]. 农业生物技术学报， 2015， 23（1）： 107-117.

[26] 张 建， 毛晓英. 酵母拮抗菌与碳酸氢钠配合对蟠桃果实采后腐烂及品质的影响[J]. 江苏农业科学， 2009， （3）： 297-299.

[27] 唐 静， 周立刚， 曹晓冬， 等. 植物提取物、 碳酸钠和碳酸氢钠室内对杨树溃疡病菌生长的抑制作用[J]. 植物病理学报， 2006， 36（5）： 446-453.

[28] Plaza P， U sall J， Torres R， et al. The use of sodium carbonate to improve curing treatments against green and blue moulds on citrus fruits[J]. Pest Management Science， 2004， 60（8）： 815-821.

[29] Fallanaj， Ippolito A， Ligorio A， et al. Electrolyzed sodium bicarbonate inhibits Penicillium digitatum and induces defence responses against green mould in citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology， 2016， 115： 18-29.

[30] Lai T， Bai X， Wang Y， et al. Inhibitory effect of exogenous sodium bicarbonate on developmentand pathogenicity of postharvest disease Penicillium expansum[J]. Scientia Horticulturae， 2015， 187： 108-114.

[31] De Costa D M， Gunawardhana H M D M. Effects of sodium bicarbonate on pathogenicity of Colletotrichum musae and potential for control in gpostharvest diseases of banana[J]. Postharvest Biology and Technology， 2012， 68： 54-63.

[32] 鄧雨艳， 明 建， 张昭其， 等. 壳聚糖诱导脐橙果实抗病性、 水杨酸及活性氧代谢变化[J]. 中国农业科学， 2010， 43（4）： 812-820.