微波辅助酶法制备米糠蛋白工艺对黄曲霉毒素B₁脱除及酶解效果的影响

林耀盛 陈智毅 张友胜 唐小俊 魏振承 张业辉 刘学铭

摘 要 以受黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染的米糠为原料，研究微波辅助酶法对米糠中AFB1脱除效果的影响。初始米糠中AFB1浓度为102.54 μg/kg，以料液比（g ∶ mL）1 ∶ 10、加酶量0.50%、α-淀粉酶和纤维素酶酶解液pH6.0、温度50 ℃、处理时间2 h的工艺条件制备米糠蛋白。结果表明，米糠中AFB1残留浓度为56.03 μg/kg（脱除率为45.36%），米糠中蛋白质回收率为78.20%；基于该工艺研究，在单位体积微波功率750 W和处理时间10 min的条件下，由酶法提取的米糠蛋白制品中AFB1残留浓度为4.21 μg/kg（脱除率为92.48%），符合国家标准（≤10 μg/kg），而蛋白质回收率达到81.36%。本研究采用免疫亲和柱净化结合HPLC-FLD检测法，提高AFB1的检出限至0.10 μg/kg。微波处理不仅对米糠蛋白中AFB1有明显的脱除效果，且有利于蛋白回收率的提高。该法操作简单，脱除效率高，可应用于受黄曲霉毒素污染的米糠制品中。

关键词 米糠蛋白；黄曲霉毒素B1；微波；脱除

中图分类号 F307.5 文献标识码 A

Abstract In this study， the efficiency through the microwave-assisted enzyme treatment degradation of AFB1 in rice bran-protein was explored. Initial concentration of AFB1 was 102.54 μg/kg， and the conditions of the enzyme treatment were solid-liquid ratio（g ∶ mL）1 ∶ 10， enzyme dosage 0.50% of α-amylase and cellulase， pH 6.0， temperature 50 ℃ and treatment time 2 h. The results showed that the concentration of AFB1 decreased 45.36% during the preparation of rice-bran protein by the enzyme treatment， and the residual concentration of AFB1 was 56.03 μg/kg， and the recovery rate of protein was 78.20%. Based on the enzyme treatment， after the treatment of microwave power per unit volume 750 W for 7 min， the degradation rate of AFB1 was 92.48%， and the residual amount of AFB1 was 4.21 μg/kg， which meets the requirement of national standard（≤10 μg/kg）， and the recovery rate of protein was 81.36%. Immunoaffinity column clean-high performance liquid chromatography-fluorescence detection method could improve the detection limit of AFB1 to 0.10 μg/kg. Microwave-assisted enzyme treatment contributed to the degradation of AFB1 in rice bran-protein and was beneficial to the recovery rate of protein. This method was simple and efficient， and it could be applied to the crops contaminated with aflatoxin.

Key words Rice bran protein； aflatoxin B1； microwave； removal

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.028

米糠是中國第一大粮食作物——稻米加工中主要副产品，是将糙米加工成精米过程中碾下的皮层以及少量米胚和碎米的混合物，约占稻谷重量的5.0%～5.5%[1]，米糠中蛋白含量超过15%，较普通精米高1倍[2]；中国每年的米糠总量超过1 000万吨，约占世界总量的1/3，来源丰富，可溶性蛋白含量较高，约占70%，与大豆蛋白接近，其营养价值可与牛乳和鸡蛋相媲美。且目前大部分米糠仍作为动物饲料，甚至直接以废物形式丢弃，造成资源的浪费。米糠虽然有较高的利用价值，但其收获、生产、加工、储藏和销售过程中，常因管理不善而发生霉变。全球每年受到真菌毒素污染的粮食约占25%，其中最主要的真菌毒素污染就是黄曲霉毒素污染。在已知的黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）中，常见且危害极大的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2），其中以AFB1致癌、致畸和诱变性最强[3]，已被国际癌症机构（IARC）确认为Ι类致癌物[4]，中国规定米制品（如米糠蛋白）中黄曲霉毒素含量≤10.0 μg/kg[5]。因此，从米糠中寻求新的天然蛋白资源，有效控制发霉米糠中的黄曲霉毒素已成为增加米糠的附加价值的关键。

提取米糠蛋白常用方法有碱法[6]、酶法[7]和物理法[8]，其中碱法是目前提取米糠蛋白最普遍的方法。虽然高浓度的碱液可以提取大部分的谷蛋白，但可能会使蛋白发生一些化学性质的变化，影响到产品风味和色泽（蛋白提取物的颜色深暗）。酶法提取，在加工过程中不会产生有害物质，是未来食品加工发展的方向，也可有效避免碱法的缺点，因酶反应的料液比较小，有利于提取液中固形物含量的提高，降低能耗，因此采用酶法来提取米糠蛋白越来越得到重视[9]。米糠蛋白的溶解性质复杂，很难有合适的单一提取方法，Tang等[10]研究表明，物理法可以使细胞破碎，从而给酶催化提供合适的环境或者增加蛋白溶解性。微波热效率高，升温时间短，在较短的时间内即达到所需的反应温度，提高生产效率，而微波物理法提取蛋白[11]，主要通过引起极性分子振动来破碎细胞，从而对释放蛋白产生显著影响效果[12]。

目前针对食品中黄曲霉毒素的脱毒方法有很多，基本可分为物理、化学、生物酶解法，但这些脱毒方法都存在安全性及食品营养损失等问题[13-14]。关于米糠蛋白的去毒目前缺乏研究，微波处理技术对某些食品物料中黄曲霉毒素的脱除效果引起关注[15-16]。本研究应用微波辅助酶法处理技术制备安全的米糠蛋白，通过免疫亲和柱净化结合HPLC-FLD的检测方法，探索微波处理对米糠蛋白中AFB1的脱除作用，确定最佳工艺，以期消除米糠中的黄曲霉毒素并提高米糠蛋白的回收率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品 米糠样品：在广州市天平架粮油市场收集米糠原料，研磨粉碎过80～100目，将筛下物密封并于4 ℃冷藏，经测定，蛋白质含量为16.72%（干基），染毒米糠中黄曲霉毒素B1含量（102.54±0.83）μg/kg（≥10 μg/kg）。AFB1标准品：纯度>99.0%，Alexis；α-淀粉酶（4 000 U/g）和纤维素酶（1 800 U/g）均购自广州市齐云生物技术有限公司。

1.1.2 试剂和仪器 试剂：NaOH、盐酸、正己烷、三氟乙酸、甲醇均为国产分析纯；乙腈、甲醇为色谱纯。

仪器：Milli-Q Integral 5超纯水系统（Merk Millpore/德国）；Sartorius BSA224S 电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；精密数显pH计（德国赛多利斯公司）；SB25-12 DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CW-2000型超声-微波协同萃取仪（中国-上海新拓微波溶样测试技术有限公司）；SB-1100水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；K8400蛋白质分析仪（FOSS ANALYTICALAB/瑞典）。

1.2 方法

1.2.1 米糠蛋白制備工艺 本研究采用微波辅助酶法制备米糠蛋白，具体制备工艺流程见图1。

（1）添加稀碱液：在室温下，取受黄曲霉毒素污染的米糠，粉碎过筛后，以1 ∶ 10（g ∶ mL）料液比加入0.08 mol/L稀NaOH溶液，调节pH至8.20，然后水浴下搅拌30～60 min；（2）加入α-淀粉酶和纤维素酶（m ∶ m=1 ∶ 1），根据预备试验和酶的活性确立了复合酶添加量为0.50%，将溶液调节pH至6.00，加入过量的α-淀粉酶和纤维素酶（经溶解过滤稀释测定，4 000 U/g和1 800 U/g）进行水解，以除去淀粉和纤维等杂质，得到酶解液；（3）微波处理：以单位体积微波功率750 W和时间10 min的条件对上述混合溶液进行处理，并不断搅拌；（4）离心：将步骤（3）所得溶液在10 ℃、10 000 r/min的条件下离心，取上清液；（5）调酸与干燥：往所得上清液中加入0.10 mol/L盐酸，调pH至4.50，产生白色沉淀，酸沉后，冷却至室温，离心，收集蛋白沉淀，水洗3次，经真空冷冻干燥后制得米糠蛋白制品。

1.2.2 微波辅助酶法制备米糠蛋白脱除AFB1工艺优化 在酶法制备米糠蛋白基础上，以AFB1脱除率和米糠蛋白得率为评价指标，分别考察不同微波功率与时间、酶解条件对米糠AFB1的脱除率和米糠蛋白得率的影响，探索AFB1脱除的最佳工艺条件。

1.2.3 AFB1含量测定 （1）样品前处理。将霉变米糠5 g经上述米糠蛋白制备工艺得到米糠蛋白制品，配制70%的甲醇水（含4%NaCl），加入15 mL 70%的甲醇水，于50 ℃超声处理20 min，以10 000 r/min、10 ℃离心10 min，取上清液，共提取3次；合并上清液并浓缩至15 mL，取4 mL溶液，加入2 mL石油醚，漩涡振荡混匀，静置分层；取下层液3 mL，将溶液稀释至8 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤，得到过滤液。

（2）免疫亲和柱净化。将亲和柱从4 ℃冰箱取出，待温度恢复至室温，倒掉柱子中保护液，用纯水清洗4～5次（每次8～10 mL）；精确加入8 mL过滤液，最后用纯水8～10 mL淋洗；待液体流干后，精确移取1 mL色谱纯甲醇洗脱，用棕色小瓶收集洗脱液。

（3）样品衍生。将洗脱液在60 ℃水浴中氮吹至近干，加200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，加盖盖紧，振荡30 s；于40 ℃水浴衍生20 min，然后再氮吹至干；最后用15%乙腈水定容至1 mL，混匀，用高效液相色谱仪检测。

（4）HPLC-FLD法测定AFB1。液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）。流动相：A（甲醇） ∶ B（乙腈） ∶ C（水）=15 ∶ 17 ∶ 68（V ∶ V ∶ V），采用等度洗脱分离；检测器：荧光检测器（λ激发=360 nm，λ发射=440 nm）、紫外检测器（λ=365 nm）；流动相流速0.80 mL/min，柱温35 ℃，进样量20 μL。

1.2.4 米糠蛋白回收率测定及AFB1脱除率的计算公式

纯度（P）/%=米糠蛋白制品中蛋白含量/米糠蛋白制品质量×100 （2）

回收率（R）/%=米糠蛋白制品含量×纯度（P）/米糠中总蛋白质含量×100 （3）

1.3 数据分析

试验重复3次，采用OriginPro 8.6作图和SPSS19.0进行数据统计，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

米糠中的AFB1检测方法采用HPLC-FLD法，结合免疫亲和柱对样品进行净化和浓缩。运用甲醇-乙腈-水混合液，其中流动相组成会影响分离度、产物以及产物的荧光发射强度[17]，运用荧光检测器检测AFB1，由于双呋喃环上具有不饱和双键的AFB1的灵敏度较低[18]，荧光强度较弱，直接测定会影响其灵敏度和准确度，满足不了对AFB1以ppb为单位的限量要求的监控，本实验通过采用强氧化剂三氟乙酸，衍生荧光物质AFB2a，从而增强检测信号，其灵敏度比衍生前提高25～50倍，检出限为0.1 μg/kg，适合定量分析。

2.1 酶法制备米糠蛋白对蛋白回收率的影响

样品分别在不同的pH、酶解温度、酶解时间下，分析其对米糠蛋白酶解效果的影响，以提高蛋白回收率为指标，探索米糠蛋白制备最佳工艺，提高其蛋白回收率。

2.1.1 不同pH对米糠蛋白回收率的影响 结果见图2，当pH<6.0时，米糠中蛋白质回收率随着pH值的升高而升高；当pH>6.0时，回收率随之降低。不同的pH会影响酶分子活性中心的催化基团的稳定性，进而影响整个反应体系的酶解速率。当pH=6.0时，米糠中蛋白质回收率达到67.75%，在最适pH值下酶的活力最大。

2.1.2 混合酶解温度对米糠蛋白回收率的影响

结果见图3，酶解温度会影响到酶的活性及反应速率。在50 ℃时，α-淀粉酶+纤维素酶预处理对米糠中蛋白含量影响较大，米糠中蛋白质回收率达到76.25%。可能是在酶解反应中，温度与酶稳定性及反应速率有关。当温度升高时，反应速率加快，有利于酶解的进行，而在50 ℃之后，随着酶解温度的提高，对米糠中蛋白质的影响反而减弱。因为温度超过55 ℃时，淀粉出现了糊化，原来的悬浊液变成了黏性很强的淀粉糊，阻碍了蛋白质的释出，导致蛋白质的回收率下降[19]。

2.1.3 不同酶解时间对米糠蛋白回收率的影响

结果见图4，酶解时间同样影响到酶的活性及反应速率。在2.0 h内，随着时间的延长，α-淀粉酶+纤维素酶预处理对米糠中蛋白质影响随之增大，可能是由于酶与底物的充分反应需要一定的时间，时间很短时，酶分子与底物结合程度较低，酶解效果不理想；延长反应时间，酶与底物充分结合，此时，酶解效果最佳；在2.0 h蛋白质回收率达到最大，继续延长酶解时间效果不显著。可能是由于酶已反应完全，活性降低。故试验选定α-淀粉酶+纤维素酶双酶酶解时间为2.0 h。当pH=6.0、酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h时，米糠中蛋白质回收率达到78.20%。

2.2 微波处理法对制备米糠蛋白過程中AFB1的影响

在酶法制备米糠蛋白工艺的基础上，以AFB1脱除率为评价指标，分别考察微波功率和微波处理时间对AFB1脱除率的影响，探索微波辅助处理对AFB1脱除的最优条件，重复操作（n=3）。

2.2.1 不同微波功率对AFB1脱除率的影响 结果见图5，在微波功率150～900 W、微波时间10 min的条件下，米糠AFB1脱除率随微波功率的增加而提高，至P=750 W时脱除率增加幅度不明显，此时微波处理对米糠中AFB1的脱除率达到84.76%。微波处理能够引起极性分子振动，从而对食品物料产生影响，被广泛应用于某些食品物料中黄曲霉毒素的脱除[20-21]。米糠中AFB1的脱除，主要原因可能一方面是由于微波的热效应，内外同步加热，引起分子快速振动，从而产生巨大热量；另一方面是由于微波的电磁震荡效应，使物料的网状结构变得疏松，增大与AFB1接触面积，共同促进AFB1的脱除[22-23]。同时考虑实际生产成本及效益，750 W时较为合适，故试验选定微波功率为750 W。

2.2.2 不同微波处理时间对AFB1脱除率的影响

结果见图6，微波功率为2～10 min时AFB1脱除率随着时间的递增变化较大，当微波处理10 min时，AFB1脱除率为92.48%；10 min后，微波处理时间对AFB1脱除率的影响不显著。其原因[24-25]如下：微波时间延长，微波热效应使温度提高，对AFB1脱除起促进效应；而处理时间过长，物料吸收热增多，吸收微波的能力反而降低，导致10 min后促进效应不显著。同时考虑到实际生产成本及效益，故试验选定微波时间为10 min。

在酶法制备蛋白工艺的基础上，考虑工艺的成本和效率，选取微波功率750 W、微波时间10 min时，黄曲霉B1脱除率达92.48%，此时米糠中AFB1的残留浓度为4.21 μg/kg，蛋白质回收率达到81.36%。

本实验通过微波辅助酶法制备米糠蛋白质，提高单纯以酶法制备蛋白质的得率，同时，该方法反应条件温和，不会产生多余的有害物质，更大程度地保留了蛋白质的营养价值。微波作为一种辅助物理处理方法，由于微波的热效应，蛋白质分子之间发生了交联，小分子聚集成大分子，而且交联部位很可能集中于疏水基团，使得米糠蛋白的亲水性提高，溶解性提高[26]。

3 讨论

本研究通过应用微波辅助酶法处理技术制备安全的米糠蛋白，AFB1残留浓度为4.21 μg/kg，符合国家限量标准（≤10 μg/kg），而蛋白质回收率提高到81.36%。由于微波的热效应，使物料的网状结构变得疏松，增加碱液与黄曲霉毒素的接触面积，有利于黄曲霉毒素与碱作用，黄曲霉毒素的脱除率提高到92.48%；同时，在弱碱性环境下进行反应，有效避免传统制备方法带来的强碱对蛋白质的变性作用以及大量钠盐离子的带入，温和无刺激性酶法，辅以微波处理作用，可产生电磁震荡效应，使得蛋白分子之间发生了交联，小分子聚集成大分子，而且交联部位很可能集中于疏水基团，使得米糠蛋白亲水性提高，溶解性也随之提高。通过微波处理条件和酶解条件前后试验对比发现，经过酶解后再进行微波处理对米糠提取物中黄曲霉脱除率的提高效果更佳，所以，在确认最优酶解条件后，利用微波辅助制备米糠蛋白工艺，制备出来的米糠蛋白产品不仅黄曲霉毒素含量低，而且米糠蛋白的溶解性有所提高，有效地解决了传统制备工艺成本高而蛋白质溶解性不高的难题，运用该工艺操作方便，节省添加大量强碱等成本，可实现产业化水平生产。这与王勇等[23]利用微波处理对稻米中黄曲霉降解的影响效果基本一致。

由于米糠中的营养物质与其细胞壁结合在一起，造成其溶解性差，难以被利用。经本课题组前期预备试验研究发现，采用传统的“碱溶酸沉”蛋白制备工艺时，制备出来的米糠蛋白产品，一方面黄曲霉毒素AFB1脱除率只达到40.65%～49.52%，残留量远远超过10 μg/kg的国家限量标准；另外，“碱溶”采用的高pH导致蛋白变性甚至产生有毒物质，“酸沉”带入过多的无机盐，而脱盐会造成蛋白质损失，制备出来的米糠蛋白，由于其自身含有较多的二硫键，影响了其在水溶液中的溶解性，导致米糠蛋白提取率降低，而且成本高，难以实现产业化水平生产。

本研究中，利用微波辅助酶法制备米糠蛋白结果表明，在料液比1 ∶ 10、微波功率750 W、微波时间10 min、α-淀粉酶和纤维素酶酶解pH6.0、酶解温度50 ℃、加酶量0.50%、酶解时间2 h的条件下，米糠中AFB1的脱除率为92.48%，降低单纯以酶法提取的米糠蛋白制品中AFB1的残留浓度，降至4.21 μg/kg，符合国家标准（≤10 μg/kg），而且蛋白质回收率提高到81.36%。该工艺操作简单，AFB1脱除效率高，可应用于受黄曲霉毒素污染的米糠蛋白制品中。

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