响应面法优化菠萝皮渣酵素的发酵工艺

南竹 曹博恒

摘要[目的]利用乳酸菌发酵菠萝皮渣制备菠萝皮渣酵素。[方法]以蛋白酶活性为指标，运用Box-Behnken Design 8.0.5v响应面法优化制作菠萝皮渣酵素的工艺参数。[结果]菠萝皮渣酵素制备的最佳工艺条件为发酵温度23 ℃，酵母菌接种量0.3%，发酵时间16.5 h。按上述工艺制得的菠萝皮渣酵素颜色均匀，酸甜适口并伴有发酵香味，有光泽。[结论]研究可为菠萝副产物的综合开发利用提供理论依据。

关键词菠萝皮渣；酵素；响应面法；发酵

中图分类号TS255文献标识码A文章编号0517-6611（2017）20-0098-03

Abstract[Objective] Preparation of pineapple peel enzyme by fermentation of pineapple peel with lactic acid bacteria .[Method]The process parameters of pineapple peel were optimized by BoxBehnken Design 8.0.5v response surface method using protease activity as an index.[Result] The optimum conditions were as follows： the fermentation temperature was 23 ℃， the inoculation amount of yeast was 0.3%， the fermentation time was 16.5 h.According to the above process made of pineapple skin residue enzyme color uniform， sweet and sour taste and accompanied by fermentation fragrance， shiny.[Conclusion] The study can provide a theoretical basis for the comprehensive utilization of pineapple byproducts.

Key wordsPineapple peel；Enzyme；Response surface method；Fermentation

菠蘿皮渣是菠蘿鲜食或生产加工后的副产物，约占全果重量的50%。研究显示，菠萝皮渣中的营养成分比例与果肉相差并不多[1]。目前菠萝生产过程中产生的皮渣多被废弃，不仅污染环境，同时浪费了大量的生物资源。如果对菠萝皮渣进一步加工制成菠萝皮渣酵素，它的经济价值会大大提高，并且可为菠萝副产物的综合利用开辟新的途径。

酵素又称作酶，是一种具有催化作用的大分子物质，深受日本及我国台湾地区人民喜爱的一种植物功能食品。酵素中含有丰富的矿物质、维生素、低聚糖、多酚、黄酮、酶和次生代谢产物等营养成分，具有美白抗氧化、抗菌消炎、润肠通便、解酒护肝、增强机体免疫力、修复机体损伤等保健功能[2-5]。但目前国内关于菠萝酵素的介绍和研究并不多见。笔者以加工生产后的废弃物菠萝皮渣为原料，利用酵母菌发酵制备菠萝皮渣酵素，探究制备的工艺条件，为菠萝的副产物综合利用以及以后的规模化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料与主要试剂。

菠萝皮渣，购置于农贸市场，低温保存；果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌，锦州医科大学医疗学院形态实验中心。

1.1.2仪器设备。

CR21G高速冷冻离心机，日本日立公司；泰光 906200 手持式折光仪，河北润联科技开发有限公司；TU-1810 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HZP-250 型全温振荡培养箱，上海精宏实验设备有限公司；血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司；真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司。

1.2工艺流程

菠萝皮渣→酶解→灭菌→接种+酵母菌发酵→浓缩→真空冷冻干燥→菠萝皮渣酵素→包装。

1.3操作要点

1.3.1酶解。将菠萝皮渣用果胶酶及纤维素酶进行酶解，水解后生成了便于吸收和利用的小分子糖类[6-7]。酶解工艺条件如下：pH 4.5，料液比1∶5（g∶mL），温度为 55 ℃，酶解时间160 min。加酶量为纤维素加酶量1.5%，果胶酶加酶量1.0%。菠萝皮渣酶解率为63.50%，可溶性固形物含量为6.23%。

1.3.2

酵母菌的活化和培养。用0.5 mL的生理盐水溶解酵母菌粉，使菌体溶解成悬浮液状态，然后将菌液在YPD培养基上进行涂布，在30 ℃恒温培养箱内培养2～3 d。菌种经过冷冻干燥后，生长延迟期较长，故需经过2次继代培养，菌液待用[8]。

1.3.3发酵液的制备。

将酶解液浓缩至可溶性固形物含量为25%[9]，适量补充营养物质。

1.3.4接种和发酵。设置温度26 ℃，pH 5.0条件下，接种0.3%酵母菌到发酵液，酵母菌初始活菌数为3.28×105 CFU/mL左右，发酵20 h。最后保持温度在18～20 ℃，静置24 h，进行后发酵，使发酵液产香[10]。

1.3.5真空冷冻干燥。

将发酵液可溶性固形物含量浓缩到45%，通过真空冷冻干燥得到水分含量小于4%的菠萝皮渣酵素粉。在冷冻温度为-20 ℃，真空度为10～20 Pa，冷阱温度为-45 ℃的条件下进行真空冷冻干燥[11]。

1.4酵母菌发酵单因素试验

1.4.1发酵温度的确定。

发酵温度的高低会直接影响酵母菌的生长繁殖和发酵产物的生成。菠萝皮渣发酵液要充分溶氧，并设置酵母菌接种量0.3%，分别在20、22、24、26、28 ℃下进行发酵，发酵时间20 h。发酵结束后测定蛋白酶活性，以确定最适的酵母菌发酵温度。

1.4.2起始pH的确定。

菠萝发酵液自身的pH在4.6左右，试验用到的葡萄酒酵母在微酸性环境下适宜生长。菠萝皮渣发酵液在充分溶氧的条件下，控制发酵温度为24 ℃，酵母菌接种量为0.3%，用CaCO3调节发酵液酸度，使pH分别在4.8、5.0、5.2、5.4、5.6 条件下进行发酵，发酵时间为20 h。发酵结束后测定蛋白酶活性，以确定最适的发酵起始pH。

1.4.3接种量的确定。

发酵液发酵的速度会随着接种量的不同而变化，并进一步影响了发酵产物的品质。菠萝皮渣发酵液在充分溶氧的条件下，控制发酵温度为24 ℃，pH为5.2，分别接种0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%酵母菌进行发酵，发酵时间为20 h。发酵结束后测定蛋白酶活性，以确定最适的酵母菌接种量。

1.4.4发酵时间的确定。

菠萝皮渣发酵液在充分溶氧的条件下，控制发酵温度为24 ℃，酵母菌接种量为0.3%，pH为5.2，发酵时间分别设置为10、15、20、25、30 h。发酵结束后测定蛋白酶活性，以确定最适的发酵时间。

1.5响应面试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选取对酵母菌发酵有显著影响的3个因素，发酵温度（A）、酵母菌接种量（B）和发酵时间（C）为自变量，以蛋白酶活性为响应值，设计3因素3水平试验，确定最佳参数进行响应面设计（表1）。

2结果与分析

2.1酵母菌发酵单因素试验

2.1.1发酵温度对蛋白酶活性的影响。由图 1 可知，发酵温度在20～24 ℃范围内的时候，蛋白酶的活性随着温度的升高而升高，在24 ℃时达到最大值。当温度超过24 ℃后，蛋白酶的活性明显降低。所以选择发酵温度在24 ℃最适宜。

2.1.2

起始pH对蛋白酶活性的影响。由图2可知，随着pH的升高，蛋白酶的活性逐渐升高，当pH超过5.2后，随着pH的升高，蛋白酶活性逐渐降低。可能是由于溶液趋于中性，抑制了酵母菌的发酵作用。起始pH为5.2时，蛋白酶活性达到最大值 2 535.70 U/g，所以确定该酵母的最适起始pH为5.2。

2.1.3

接种量对蛋白酶活性的影响。由图3可知，酵母菌的接种量在0.20%～0.25%时，蛋白酶的活性迅速升高，在0.25%时达到最高点，蛋白酶的活性为2 582.30 U/g。当接种量超过0.25%后，蛋白酶活性基本保持不变并略有降低。综合考虑实际生產及经济等因素，选择酵母菌的最适宜接种量为0.25%。

2.1.4发酵时间对蛋白酶活性的影响。由图4可知，蛋白酶的活性随着发酵时间的延长而增加，但到15 h后，蛋白酶活性增长的速度并不明显，所以将发酵时间选在15 h比较适宜。

2.2酵母菌发酵工艺条件优化

2.2.1响应面试验结果。该试验采用Design-Expert 8.0.5v进行响应面设计，获得的结果详见表2，对表2进行回归分析，得到回归方程：Y=521.18-34.68A+7.53B- 83.03C+18.83AB+34.72AC+15.81BC-60.48A2-64.39B2-70.90C2。

2.2.2响应面分析与方差分析结果。

图5、6、7分别表示的是两两因素的交互作用对蛋白酶活性的影响。如图5所示，随着发酵温度的升高及酵母菌接种量的增大，蛋白酶活性都是先升高后降低，两者交互作用使蛋白酶的活性达到最大值为2 485.30 U/g；如图6所示，发酵温度与发酵时间两者交互作用的最大值达2 452.70 U/g；由图7可知，酵母菌接种量和发酵时间对蛋白酶活性的影响都较大，两者交互影响蛋白酶活性的最大值达2 558.20 U/g。通过软件分析，得到菠萝皮渣酵素发酵的最佳工艺是发酵温度22.98 ℃，酵母菌接种量0.29%，发酵时间16.39 h，考虑到实际生产的需要及可操作性，修正其工艺条件为发酵温度为23 ℃，酵母菌接种量为0.3%，发酵时间为16.5 h，重复试验3次，得到蛋白酶活性分别为2 549.70、2 543.60和2 547.10 U/g，其平均值为2 546.80 U/g，与模型的预测值2 559.60 U/g较为接近，说明该模型对菠萝皮渣酵素制备的预测具有实际意义。

2.3真空冷冻干燥制备菠萝皮渣酵素产品质量指标

试验制得的产品质量各指标如下：①色泽：颜色均一的淡黄色。

②气味：菠萝特有的酸甜果香味及发酵香味。③酸度：酸甜适口。④组织形态：松散无结块。

3结论

该试验选用菠萝加工后的废弃皮渣为原料，利用乳酸菌进行发酵制备酵素，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken响应面设计进行试验并分析数据，再结合实际操作情况，获得制备菠萝皮渣酵素的工艺条件为发酵温度23 ℃，酵母菌接种量0.3%，发酵时间16.5 h，在此条件下，制得的菠萝皮渣酵素颜色均匀，酸甜适口并伴有发酵香味，蛋白酶活性为2 546.80 U/g。该试验结果可以为规模化生产及功能性产品的开发提供理论依据，其理化性质及稳定性有待进一步研究。

参考文献

[1] 杨瑞，翟海瑞，杨劲松.菠萝皮渣生产虾青素的发酵条件研究[J].食品工业科技，2011，32（9）：261-266.

[2] 罗建平，徐学玲，潘利华，等.菠萝皮渣多糖的提取与体外抗氧化活性研究[J].食品科学，2009，30（18）：172-175.

[3] 蒋增良，毛建卫，黄俊，等.葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化性能的变化[J].中国食品学报，2014，14（10）：29-34.

[4] 赵金凤，曲佳乐，皮子凤，等.植物酵素润肠通便保健功能研究[J].食品与发酵科技，2012，48（3）：54-56.

[5] 曲佳乐，赵金凤，皮子凤，等.植物酵素解酒护肝保健功能研究[J].食品科技，2013，38（9）：51-54.

[6] 赵金凤，宿秀芹，曲佳乐，等.敖东酵素对脾淋巴细胞增殖作用的影响[J].食品与发酵科技，2014，50（3）：50-52.

[7] 蔡爽.人参术苓酵素的制备及改善肠胃功能研究[D].长春：吉林大学，2013.

[8] 董银卯，何聪芬，王领，等.火龙果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009，34（3）：192-196.

[9] 杨培青，李斌，颜廷才，等.蓝莓果渣酵素发酵工艺优化[J].食品科学，2016，37（23）：205-210.

[10] WANG S Y，CHEN H J，EHLENFELDT M K.Variation in antioxidant enzyme activities and nonenzyme components among cultivars of rabbiteye blueberries（Vaccinium ashei Reade）and V.ashei derivatives[J].Food chemistry，2011，129（1）：13-20.

[11] 李加兴，孙金玉，陈双平，等.猕猴桃果醋发酵工艺优化及质量分析[J].食品科学，2011，23（24）：306-310.