抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究

李龙　孙慧　刘泽玉

摘要[目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法。[方法]选取对 BmNPV 具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象，对它们进行添食 BmNPV 病毒处理。提取家蚕的血淋巴，运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测。[结果]筛选出优化的体积排阻色谱分离条件：YarraTM SEC-2000分离柱，30 mmol/L Tris-醋酸为流动相（pH 7.4），流速0.5 mL/min。建立了分离与检测家蚕血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS联用技术。BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分。[结论]制备了葡聚糖G100凝胶柱分离并收集可能与BmNPV 抗性相关的家蚕血液分离液，为家蚕金属蛋白的分离提供更简便有效的方法。

关键词家蚕；BmNPV；抗性；体积排阻色谱；电感耦合等离子体质谱

中图分类号S881.2文献标识码A文章编号0517-6611（2017）20-0111-06

Abstract[Objective] To study the separation methods of copper compounds related to BmNPV resistance in hemolymph of Bombyx mori. [Method] B. mori cultivars with and without BmNPV resistance were selected as research objects to feed BmNPV virus.Cu compounds was extracting and determinated from hemolymph of two groups B.mori by SECICPMS.[Result] The optimal seperation conditions for size exclusion chromatography were as follows：YarraTM SEC2000，30 mmol/L Trisacetic acid（pH 7.4） as mobile phase， flow rate of 0.5 mL/min. SECICPMS technology for separating and detecting copper compounds in hemolymph of B. mori was established. The main differences of copper compounds between resistant cultivars of B. mori and nonresistant cultivars of B. mori was the compounds with the retention time of 7.6 min. [Conclusion] The separation liquid of hemolymph of Bombyx mori might be related with BmNPV resistance seperated and collected by glucan G100 gel column was prepared. The research can provide simpler and more effective methods for the seperation of metal proteins in B. mori.

Key wordsBombyx mori；BmNPV；Resistance；Size exclusion chromatography；ICPMS

蠶丝产业在我国已有5 000多年的历史，长久以来为中华民族文化、经济和社会发展做出了重大贡献[1]。然而，每年因蚕病感染造成的损失占蚕业生产总收入的20%左右[2]，其中因为家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染带来的家蚕核型多角体病毒病在家蚕的生长中非常多见，对蚕业生产的危害极，大约占蚕病给蚕茧造成经济损失的70%[3]。在过去的几十年，对BmNPV的研究主要集中在鉴定、分类[4]、感染途径[5]、生物反應器[6]和杀虫剂[7]的研究，在家蚕抗病毒感染机制方面的研究甚少。徐安英等[8]利用从家蚕种质资源中筛选出的具有抗BmNPV病的显性基因，采用杂交、回交及系统选育的方法，培育出适应不同季节、蚕区的抗BmNPV品种，即华康1号、华康2号。科学家们在筛选出抗BmNPV家蚕品种的同时，也深入研究了家蚕对BmNPV抗性的分子机制。2013年，Feng等[9]筛选出对BmNPV抗性家蚕NB品种，并对其遗传规律进行了重新分析，结果发现抗性表现出单基因控制的遗传规律，认为这些规律可能是由于抗性品种的不断筛选，使得家蚕的主效基因被强化，微效基因的作用则愈加不明显。

迄今为止，科学家们获得许多与家蚕对BmNPV抗性有关的分子标记信息，但目前还不能利用分子标记和图位克隆的方法定位抗性基因，因此，人们考虑从不同的组学研究方法入手进行相关机理的探索，尤其是蛋白质组学。关于家蚕抗NPV蛋白质组水平研究还处于起步阶段，目前各研究小组通过多种大通量组学方法获得了一些家蚕抗BmNPV的差异表达基因和蛋白质，这些不同方法获得的数据可以相互验证、相互补充。例如，无论是在蛋白水平还是在mRNA水平，感性品系中的家蚕胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（Trypsin-like serine protease）、家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂5（Bmserpin-5）和家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂CI-8A（Chymotrypsin inhibitor CI-8A）在添毒后没有明显变化。但是，这些酶在抗性家蚕中肠和脂肪体中的表达显著上调，表明与这些因子相关的酚氧化酶级联途径在家蚕抗BmNPV的过程中确实起到一定的作用[10-12]。

金属组学是蛋白质组学的重要组成部分，生物体内约1/3的蛋白质与微量元素（主要是金属元素）结合形成金属蛋白或金属酶[13]。这些金属元素的存在对于蛋白结构的稳定和功能的发挥是必不可少的。体内微量元素水平的反常、存在形态的变化以及特定的金属酶、金属蛋白的表达、定位、结构、功能等的变化常常与某些病理状态相关，甚至是关键的病理环节。金属蛋白在结构维持、金属离子存储和转运、电子传递、分子识别与催化、基因表达调控、信号转导、氧化应激等方面都发挥着非常重要的作用[14]。目前，对家蚕金属蛋白的研究报道较少，已有的报道主要涉及金属酶和一些金属蛋白的分离纯化及部分性质的研究。目前，已经鉴定出的家蚕金属蛋白酶包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）以及过氧化物酶（POD）[15-17]。研究表明，某些金属元素会影响家蚕体内其他酶[如碱性磷酸酶（AKP）和家蚕丙氨酸转氨酶（ALT）等]的活性作用[18-19]，但是由于分离与纯化技术的限制，这些金属蛋白酶的作用机制尚不明确。

为了探明各金属蛋白在不同生化过程中的作用机理和在生物体的不同生物功能，研究这些金属蛋白的结构、含量及其在生物组织中的分布与变化规律往往是十分必要的，而金属蛋白的提取和分离又是实现准确的金属蛋白结构预测和定量分析的前提[20]。常用的蛋白分离技术包括高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）和电泳等技术。其中，高效液相色谱用于分离金属蛋白时，对金属与蛋白的结合影响较小，保证了金属蛋白在分离过程中的完整性。Yang等[21]建立了体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱法，同时测定了印度芥菜中镉、铜、锌形态分析方法，并检测到3种金属的4种结合肽形态。赵艳芳等[22]運用体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术分析了高镉累积扇贝中镉与蛋白质或肽的结合形态，共检测到 3种镉形态：金属硫蛋白（MT）-Cd、谷胱甘肽（GSH）-Cd、半胱氨酸（Cys）-Cd。为了满足复杂生物样品的分离，目前还发展了多维 HPLC技术。多维 HPLC 是利用2种或2种以上的分离机理不同的模式对复杂样品进行分离的一种技术，它是将由第1种分离模式分离的全部或部分组分转入到另1种或几种不同类型的分离模式中进行进一步分离，从而大大提高了整个系统的分离效果和峰容量[23-24]。Barnett等[25]利用离线的二维 SEC/SAX（阴离子交换色谱）模式分离蓝藻体内金属蛋白，并与用凝胶电泳法分离的金属蛋白进行了对比，结果发现二维 SEC/SAX 分离后质谱得到了更多的预期和非预期金属结合蛋白，同时展现出色谱方法分离金属蛋白的优势，即不需标记、可保持蛋白活性以及分离速度快等。

Cu是许多酶中的必需元素，Cu与有机配体形成的配合物不仅具有氧化、还原、催化、超分子化合物结构控制等重要作用，而且具有抗菌、抗癌、抗病毒等生物活性[26]。家蚕体内血淋巴中的Cu元素含量在0.5 μg/mL左右，中肠和脂肪体中含量更高[27]。因此，笔者尝试从Cu金属化合物层面，分析家蚕抗性与某些Cu金属化合物的潜在联系，为研究家蚕对BmNPV的抗性机制提供线索。笔者选取对 BmNPV 具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象，对其进行添食 BmNPV 病毒处理，提取供试家蚕的血淋巴，用SEC-ICP-MS 联用技术对2组样品中Cu金属化合物进行分离和检测，同时考察了体积排阻色谱流动相的组成、色谱柱填料和流速等对家蚕血淋巴中铜化合物分离效果的影响，筛选出优化的分离条件。另外，建立了HPLC结合葡聚糖凝胶柱的方法，分离出可能与家蚕抗BmNPV相关的Cu化合物组分，旨在为今后这些可能与抗性相关Cu化合物的鉴定提供更加有效的分离方法。

1材料与方法

1.1供试材料、仪器与试剂

1.1.1供试材料。

家蚕品种和白玉N由中国农业科学院蚕业研究所保存，白玉N为抗病品种，白玉为其非抗性非抗性品种，抗性品种的遗传背景与非抗性品种的相似度为999%；BmNPV由中国农业科学院蚕业研究所病理组提供，浓度为1.0×109多角体/mL。

1.1.2仪器。

e2695 高效液相色谱仪，为美国 Waters公司产品；TSK-GEL G3000SWxL 色谱柱，为日本 TOSOH 公司产品；YarraTM SEC-2000色谱柱，为美国菲罗门公司产品；ICP-MS X Series 2型电感耦合等离子体质谱仪，为美国Thermo Fisher公司产品；MilliQ超纯水仪，为法国Millipore公司产品；MS303S分析天平，为瑞士Mettler Toledo 仪器有限公司产品；Allegra X-22R 多功能高速离心机，为美国Beckman Coulter 公司产品；EL20 PH计，为瑞士Mettler Toledo仪器有限公司产品；Waters Fraction Collector，为美国Waters公司产品。

1.1.3试剂。

Tris、醋酸、盐酸、醋酸铵，均为分析纯；甲醇为色谱纯；葡聚糖G100购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2试验方法

1.2.1样品制备及前处理。

将饲养至5龄的抗性和非抗性家蚕分别分成2组：1组在5龄第1天接种BmNPV病毒（10 μL/头）（将病毒涂抹在叶子上，稍微晾干，喂食家蚕）；另1组为对照组。供试家蚕被分为4组：抗性对照组、抗性染毒组、非抗性品种对照组、非抗性染毒组。添食病毒后4组家蚕喂食无病毒桑叶饲养至5龄第5天，剪破第二腹足取每组家蚕血液，于4 ℃下10 000 r/min离心20 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存，备用。使用前解冻，并用0.22 μm滤膜过滤。

1.2.2SEC-ICP-MS法检测家蚕血液中Cu金属化合物的差异。

1.2.2.1体积排阻-高效液相色谱条件的选择。

为了使家蚕血淋巴中Cu金属化合物得到更好的分离效果，选取3种流动相、2种色谱柱和4种流速进行比较，筛选出良好的色谱分离条件。3种流动相分别为A（30 mmol/L 醋酸铵缓冲液，pH 7.4）、B（30 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.4）、C（30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液，pH 7.4）。2种不同填料的色谱柱：TSK-GEL G3000SWx（300 mm×7.8 mm，5 μm）和YarraTM SEC-2000（300 mm×7.8 mm，3 μm）。流速分别为04、05、0.6、0.7和0.8 mL/min。使用紫外检测器，检测波长280 nm，柱温25 ℃，进样量50 μL。

1.2.2.2SEC-ICP-MS分离检测家蚕血液中的Cu金属化合物。

配制10 mg/L Li、Co、In、U多元素混合质谱调谐液调节ICP-MS的灵敏度，用PEEK管将HPLC与ICP-MS的雾化器连接起来，组成SEC-ICP-MS联用系统。4组家蚕血液过0.22 μm滤膜，注入SEC-ICP-MS联用系统，将ICP-MS作为检测器，在线监测家蚕血液中Cu金属化合物。HPLC的流动相为30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液（pH 7.4），YarraTM SEC-2000色谱柱，流速0.7 mL/min，柱温25 ℃，进样量50 μL。ICP-MS的工作条件如表1所示。

1.2.3特定馏分的Cu金属化合物的收集方法的选择。

1.2.3.1SEC- HPLC结合馏分收集器手动收集7.6 min组

分。

以30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液（pH 7.4）为流动相，用YarraTM SEC-2000色谱柱与馏分收集器，以0.7 mL/min流速，在waters高效液相色谱仪上对家蚕血液进行SEC分离，检测波长280 nm，柱温25 ℃，进样量50 μL。馏分收集器手动收集7.6 min谱峰馏分，收集的馏分再次以相同的SEC条件进行色谱分离。

1.2.3.2葡聚糖G100凝胶柱分离收集目标Cu金属化合物馏分。

称取5 g葡聚糖G100用200 mL纯水浸泡24 h，倒去上层水，制成凝胶备用。用凝胶等体积的1.0 mol/L的NaOH溶液浸泡凝胶3 h，加水后轻轻搅拌，静置5 min后倒掉上层水及未沉淀的细颗粒，如此反复3～5次，然后将凝胶沿着搅拌棒逐次缓慢的加入柱中。组装完成后，将血液样品缓慢加入到层析柱中，同时利用泵以固定流速加入洗脱液（30 mmol/L的Tris-盐酸，流速1.0 mL/min），每分钟收取1次分离液。收取的分离液以30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液（pH 7.4）为流动相，用YarraTM SEC-2000色谱柱，以0.7 mL/min流速，检测波长280 nm，柱温25 ℃，进样量50 μL，在waters高效液相色谱仪上对家蚕血液进行SEC分离，检测收集的组分的出峰时间和峰高。

45卷20期李 龙等抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究

2结果与分析

2.1体积排阻-高效液相色谱条件的选择

目前，家蚕血液蛋白质组学已取得很大的研究进展，但由于蛋白分离技术的限制，仍有很大的研究探索空间。目前蛋白质分离的传统主流技术是双向凝胶电泳技术，但是其具有重复性差、灵敏度低等缺点，而逐步发展的液相色谱等新型分离技术有补充和取代双向凝胶电泳的趋势。体积排阻色谱（SEC）分离蛋白质回收率高，不会造成蛋白的损失，是最常用的初步筛选未知样品中化合物的方法[28]。影响体积排阻色谱法分离效果的因素有很多，包括色谱柱填料、流动相、pH、流速等。金属与生物大分子生成的络合物和金属离子之间的平衡与溶液的 pH 密切有关，在分析體液时，常用相当于生理状态的缓冲液（pH 7.4）[29]，因此，该试验选用分离家蚕血液的体积排阻色谱流动相的pH为7.4。同时，考察了不同的色谱柱、流动相以及流速对分离效果的影响。SEC所用的流动相一般为水相，以防止金属蛋白被破坏或蛋白变性。最常用的分离体液的缓冲液是10～50 mmol/L Tris-HCl和Tris-醋酸，也有少数文献使用Tris-醋酸铵。因此，比较了这3种缓冲液（30 mmol/L，pH 7.4）的对抗性对照组家蚕血淋巴的分离效果。从图1可以看出，3种流动相均可以对照组家蚕血淋巴成分进行分离，但通过比较三者的峰型、峰的数量发现，流动相30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液、pH 7.4对家蚕血淋巴蛋白组分的分离效果较好（图1c），因此选取 30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液、pH 7.4作为家蚕血淋巴金属化合物分离的流动相。

缓冲液的洗脱流速也是影响分离效果的重要因素。考察了流速分别为0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL/min时对抗性对照组家蚕血液分离的影响。结果表明，当流速为0.7 mL/min时样品在色谱柱中的扩散效应影响较小，并且分离度较高（图1c），因此选择流速为0.7 mL/min。

理想的排阻色谱样品与固定相之间应该没有相互作用力，固定相表面应为亲水性的羟基，但是由于填料合成时实验条件的限制，固定相表面不可避免的存在一些羧基、氨基等带电基团，因此溶质与固定相表面会有一些静电作用力[30]。因此，考察了TSK-GEL G3000SWx（300 mm×7.8 mm，5 μm）和YarraTM SEC-2000（300 mm×7.8 mm 3 μm）2种不同型号的体积排阻色谱柱对抗性对照组家蚕血液化合物分离的影响，结果如图2所示。比较二者的峰形、峰的数量可以看出，YarraTM SEC-2000色谱柱的分离效果较好。因此，最终选择的分离条件如下：YarraTM SEC-2000分离柱，流动相 30 mmol/L Tris-醋酸缓冲液（pH 7.4），流速0.7 mL/min。

2.24组家蚕血液中的Cu金属化合物的差异比较

ICP-MS具有高灵敏度以及可多元素同时分析等特点，已成为金属蛋白中金属元素分析必不可少的方法[31]。ICP-MS 可直接用于经液相色谱分离后的金属蛋白中金属元素种类及含量的检测，且因其具有分析同位素比值的能力，结合同位素稀释法可以对色谱分离所得到的未知金属元素进行准确定量[32-33]。采用SEC-ICP-MS方法测定了家蚕血液中Cu金属化合物，分离结果如图3所示。体积排阻色谱是根据分子量大小分离样品的，大分子物质在柱内的保留时间短，所以先出峰，分子量小的蛋白在柱内的保留时间长而后出峰。结合抗性对照组家蚕血淋巴蛋白在SEC中的出峰时间（图2b），比较Cu金属与抗性对照组家蚕血液中化合物的结合情况（图3a）可知，Cu元素在家蚕血液的多数出峰时间内都可以被检测到，说明Cu结合的化合物分子量范围较广，与大分子和小分子化合物均有结合。对比添食病毒前后抗性和非抗性家蚕血淋巴Cu元素的金属谱峰（图3）可知，4组家蚕血淋巴 Cu 结合化合物有明显差异。抗性正常组（图3a）有3处明显峰：7.6、11.0、和18.0 min，12.0～14.0 min检测到2个信号强度很弱的谱峰。非抗性正常组（图3b）有2处明显峰：110和18.0 min，12.5和13.5 min谱峰不明显。抗性家蚕组的18.0 min峰的Cu金属信号强度明显强于非抗性家

蚕。抗性家蚕在被喂食BmNPV 5 d后，7.6 min峰消失，

11.0 min峰的金属信号强度和峰面积都明显降低，峰的形状

也不明显（图3c）；非抗性家蚕感染BmNPV 5 d后，0～16.0 min几乎检测不到峰，只出现一个18.0 min峰（图3d）。因此，抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异在7.6 min峰。

2.3葡聚糖G100凝胶柱分离收集特定Cu金属化合物馏分

4组家蚕血淋巴的Cu金属化合物的SEC-ICP-MS分离结果表明，正常的抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异在7.6 min峰，而抗性家蚕喂食BmNPV后也几乎检测不到7.6 min峰，据此推测这种差异可能与家蚕对BmNPV的抗性有关。为了后续的检测鉴定，需要分离并收集7.6 min馏分，借助质谱手段对其做定性分析。常用的方法是利用馏分收集器，根据液相色谱仪的检测信号手动收集样品馏出液，多次收集，合并馏分，减压浓缩后借助质谱手段定性分析。这个方法要求准确计算样品流出液从色谱柱到馏分收集器的时间。从家蚕血液的SEC-HPLC色谱分离图可以看出，分离的7.6 min峰的出峰时间只有1 min，因此色谱柱到馏分收集器的时间计算准确度对结果的影响较大。此外，与葡聚糖凝胶柱分离相比，HPLC的进样量较少，直接利用HPLC收集得到的馏分样品浓度太低（图4a）。

分离效果图。图4a是直接利用馏分收集器从HPLC手动收集的家蚕血液馏分分离图，图4b是葡聚糖凝胶柱分离家蚕血液并手动收集7.6 min分离液的SEC-HPLC分离效果图。4a图中峰高和峰面积明显小于图4b。因此，直接利用馏分收集器从HPLC手动收集的家蚕血液馏分需要多次收集合并，并对馏分进行浓缩才可以进行质谱鉴定。这种方法工作量繁琐，同时浓缩的过程中可能会破坏Cu结合金属化合物。因此，用葡聚糖G100凝胶柱结合HPLC的方法分离并收集目标Cu金属化合物馏分，分离所得的分离液经HPLC法进行纯度检测，检测结果如图5所示。4组家蚕血液的分离液在0～30 min时间内只出现一个7.6 min谱峰，说明收集的

家蚕血液分离液成分相对简单，至少分子量相似。4组家蚕血液分离液的7.6 min谱峰中抗性正常组最高，非抗性染毒组最低，这种差异趋势与SEC-ICP-MS分离结果相一致。

3結论

笔者筛选出相对优化的体积排阻色谱分离条件，建立了SEC-ICP-MS联用技术来分离与检测家蚕血液中的Cu金属化合物。结果表明，BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分。同时，利用葡聚糖G100凝胶柱重点对7.6 min组分进行了分离并收集分离液。此方法比传统的HPLC-馏分收集器收集的馏分浓度高，可省去再次对馏分进行合并和浓缩等步骤，是家蚕金属化合物分离较为简便和有效方法。

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