羧甲基壳聚糖及羧甲基甲壳素对TGF-β诱导的角膜上皮纤维化的抑制作用研究❋

王哲颖， 隋爱华， 徐文华❋❋， 刘成玉❋❋， 周 泉， 王丽萍， 梁 晔

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266003； 2.青岛大学附属医院中心实验室，山东 青岛 266003)

羧甲基壳聚糖及羧甲基甲壳素对TGF-β诱导的角膜上皮纤维化的抑制作用研究❋

王哲颖1， 隋爱华2， 徐文华1❋❋， 刘成玉1❋❋， 周 泉2， 王丽萍2， 梁 晔2

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266003； 2.青岛大学附属医院中心实验室，山东 青岛 266003)

本实验旨在研究不同分子量的羧甲基壳聚糖 (CMCTS) 和羧甲基甲壳素 (CMCT) 对转化生长因子β (TGF-β)诱导的人角膜上皮细胞纤维化的抑制作用，并初探其作用机制。MTT法检测不同分子量的CMCTS和CMCT对人角膜上皮细胞系 (HCE) 生长增殖能力的影响；细胞划痕实验研究TGF-β诱导的HCE细胞纤维化过程中CMCTS和CMCT的作用；western blot方法在蛋白水平探究不同分子量的CMCTS和CMCT对角膜上皮细胞纤维化相关的TGF-β/Smad通路信号分子的影响。结果表明，在10～1 000 μg/mL浓度范围内，4种多糖对HCE细胞均具有较好的相容性。此外，不论大分子还是小分子的CMCTS对TGF-β诱导的HCE细胞纤维化均具有显著的抑制作用，其作用机制与抑制TGF-β/Smad信号通路Smad2和Smad3分子的磷酸化有关。然而，两种分子量的CMCT均没有抑制纤维化的作用。因此，CMCTS可以作为一种有发展潜力的生物医用材料应用于人角膜上皮损伤修复，发挥其抗纤维化的作用。

羧甲基壳聚糖； 角膜上皮； 纤维化； TGF-β

羧甲基壳聚糖 (Carboxymethyl chitosan, CMCTS) 和羧甲基甲壳素(Carboxymethyl chitin, CMCT) 是壳聚糖和甲壳素改性研究中应用最多的衍生物之一，相较壳聚糖和甲壳素而言，CMCTS和CMCT既保留了它们的优点，又极大的改善了其水溶性[1]。经研究表明，CMCTS和CMCT不仅具有良好的生物相容性、生物可降解性和成膜性[2-3]，还具有抑菌、抗氧化和抗癌等多种生物学活性[4-6]。

角膜损伤修复的过程常常会导致纤维瘢痕的形成，在此过程中转化生长因子β (Transforming growth factor-beta, TGF-β)等细胞因子的分泌升高，引起正常角膜上皮细胞向成纤维细胞转化，是角膜纤维化过程的重要特点[7]。研究表明，CMCTS在皮肤、腹膜、跟腱、硬脑膜外等多种组织或器官中均表现出抗纤维化和抑制瘢痕粘连的作用[8-11]，据此推测，CMCTS和CMCT在角膜损伤修复中也可能具有抗纤维化的作用。但是这种抗纤维化作用的机制目前尚未明确。

因此，本实验用MTT法检测不同分子量的CMCTS和CMCT对人角膜上皮细胞系(HCE) 细胞的生长增殖能力的影响；用TGF-β体外诱导HCE纤维化，通过细胞划痕实验研究CMCTS和CMCT对TGF-β诱导的HCE细胞纤维化的抑制作用；以及通过western blot实验从蛋白水平探究CMCTS和CMCT对角膜上皮的抗纤维化作用的机理，为其在角膜组织工程领域的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

不同分子量的CMCTS和CMCT：大分子CMCTS (CMCTS-1，脱乙酰度96%，相对分子量134 kDa)，小分子CMCTS (CMCTS-2，脱乙酰度96%，相对分子量42 kDa)，大分子CMCT (CMCT-1，相对分子量115 kDa)，小分子CMCT (CMCT-2，相对分子量37 kDa)均由本实验室制备。HCE细胞源自ATCC细胞库。

1.2 试剂与仪器

1640培养基、胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 及胰蛋白酶 (美国Gibco)，噻唑蓝(MTT，美国Sigma)，TGF-β (美国R&D)，其它试剂均为国产分析纯。

磷酸化Smad2 (phospho-Smad2, P-Smad2, Ser465/467) 抗体、磷酸化Smad3 (phospho-Smad3, P-Smad3, Ser423/425) 抗体、Smad2抗体和Smad3抗体均购自美国CST，GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 抗体购自美国Sigma。

CO2培养箱(芬兰Thermo)，倒置显微镜(日本Olympus)，全波长酶标仪 (芬兰Thermo)，成像分析仪 (法国Vilber Lourmat)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞增殖率实验 用含10% FBS的1640培养基将对数生长期的HCE细胞配制成5 × 104个/mL细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔细胞培养板上，置于CO2培养箱 (37 ℃, 5% CO2) 中培养过夜。实验组分别加入不同浓度 (10、 50、 100、 500和1 000 μg/mL)的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2，对照组加入1640培养液，以同样处理但不接种细胞的孔作为空白孔，每组设立3个平行孔。培养24 h后在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，MTT法测定各孔在490 nm波长下的吸光度值。按下式计算细胞的相对增殖率 (relative growth rate, RGR)：

RGR(%)=(OD1-OD0)/(OD2-OD0)×100%。

其中OD0、OD1、OD2分别表示空白孔、实验孔和对照孔的吸光度值。

1.3.2 细胞划痕实验 用含10% FBS的1640培养基将对数生长期的HCE细胞配制成1×105个/mL的细胞悬液，接种于12孔细胞培养板上，置于CO2培养箱 (37 ℃, 5% CO2)中培养过夜，用1640培养基同步化处理4 h以上。将TGF-β诱导组细胞预先在10 ng/mL的TGF-β中激活1 h，划线后，分别换为新的TGF-β (10 ng/mL)和4种不同分子量的糖(10 μg/mL)+TGF-β(10 ng/mL)继续培养；非TGF-β诱导组细胞划线后，分别换为4种不同分子量的糖溶液 (10 μg/mL)，对照组直接加入培养基培养；分别于0、24 h在倒置显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。按下式计算细胞相对迁移率：

非TGF-β诱导组细胞相对迁移率(%) = S1/S0× 100%，

TGF-β诱导组细胞相对迁移率 (%) = S3/S2× 100%。

其中S0，S1，S2和S3分别表示对照组、非TGF-β处理组、TGF-β组和糖+TGF-β处理组的细胞迁移面积。

1.3.3 Western blot实验 将对数生长期的HCE细胞均匀接种于24孔细胞培养板，置于CO2培养箱 (37 ℃, 5% CO2) 中培养过夜后，用1640培养基同步化处理4 h以上。将TGF-β诱导组细胞预先在10 ng/mL的TGF-β中激活1 h，然后分别换为新的TGF-β (10 ng/mL)和4种不同分子量的糖(10 μg/mL)+TGF-β(10 ng/mL)继续培养；非TGF-β诱导组细胞分别换为4种不同分子量的糖溶液 (10 μg/mL)，对照组直接加入培养基培养。最后，于培养后1和24 h分别用含SDS的RIPA蛋白裂解液收取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量，定量后取各样本30 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将目标蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后加入相应目的蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入辣根酶标记的二抗孵育1 h，洗涤后与发光试剂反应，用成像分析仪显影后计算各条带的灰度值，反映各组细胞TGF-β/Smad通路相关信号分子P-Smad2，P-Smad3以及总Smad2和总Smad3的表达情况。

1.4 统计学分析

实验数据应用SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析 (one way ANOVA) 或Student′s t检验，P<0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 不同分子量的CMCTS和CMCT对HCE细胞增殖的影响

HCE细胞在浓度分别为10,50,100,500,1 000 μg/mL的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2中培养24 h后，MTT实验结果如图1、2中所示。各实验组RGR与对照组比较没有统计学差异(P>0.05)，表明当浓度范围在10～1 000 μg/mL时，CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2均不会对HCE的生长增殖造成影响，4种多糖对HCE细胞均具有较好的相容性。

2.2 CMCTS和CMCT对TGF-β诱导的HCE细胞迁移能力的影响

在TGF-β诱导下，角膜上皮细胞发生纤维化，使细胞的迁移速率增高[12]。本实验中，分别于培养后0和24 h在倒置显微镜下观察各实验组和对照组HCE细胞的迁移情况并拍照。

(n = 3, mean±SD, P>0.05)图1 不同分子量的CMCTS对HCE细胞增殖的影响Fig.1 Effect of CMCTS with different molecular weights on the growth of HCE cells

(n = 3, mean±SD, P>0.05)图2 不同分子量的CMCT对HCE细胞增殖的影响Fig.2 Effect of CMCT with different molecular weights on the growth of HCE cells

实验结果如图3中所示，非TGF-β诱导组中，CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2的细胞相对迁移率与对照组相比没有统计学差异(P>0.05)，表明浓度为10 μg/mL的CMCTS-1，CMCTS-2，CMCT-1和CMCT-2不会对正常HCE细胞的迁移能力造成影响。如图4所示，在TGF-β诱导组中，CMCTS-1和CMCTS-2的加入会明显降低HCE细胞的迁移速率(P<0.05)，其中CMCTS-1 + TGF-β组细胞迁移速率的降低程度最显著(P<0.01)；而CMCT-1 + TGF-β和CMCT-2 + TGF-β组HCE细胞的迁移速率与TGF-β组相比无明显差异(P>0.05)。

实验结果表明，CMCTS-1和CMCTS-2具有抑制TGF-β诱导的HCE细胞纤维化的作用，从而抑制了细胞迁移速率的增高；而CMCT-1和CMCT-2不具有这种作用。

2.3 CMCTS和CMCT对角膜上皮纤维化相关TGF-β/Smad信号通路的影响

2.3.1 CMCTS和CMCT对TGF-β/Smad信号通路磷酸化水平的影响 TGF-β/Smad信号通路是角膜损伤后纤维化形成的最关键的分子通路[13]，本实验在蛋白水平进一步探讨了不同分子量的CMCTS和CMCT对HCE细胞TGF-β/Smad信号通路的影响。

在TGF-β/Smad信号通路中，Smad2和Smad3分子的磷酸化过程一般发生在最初的数小时内[14]。由图5可见，两种分子量的CMCTS对TGF-β活化后1 h内Smad2和Smad3分子的磷酸化均具有明显的抑制作用，与TGF-β组比较差异有统计学意义 (P<0.01)，而Smad2和Smad3分子的总量没有明显的变化(P>0.05)，结果以GAPDH标准化。并且，CMCTS-1对Smad2和Smad3分子磷酸化的抑制作用比CMCTS-2更加显著(P<0.001)。由图6可见，两种分子量的CM-CT对TGF-β活化后1 h内Smad2和Smad3分子的磷酸化和总量均没有明显的影响(P>0.05)，结果以GAPDH标准化。

(n = 3, mean±SD, P>0.05)图3 非TGF-β诱导组HCE细胞在培养后0和24 h光镜下细胞迁移情况(a)和细胞相对迁移率(b)Fig.3 Cell migration (a) and the relative migration rate (b) of HCE cells cultured without TGF-β for 0 and 24 h

(n=3, mean±SD,*P<0.05, **P<0.01。* denotes significant difference compared with the group treated only with TGF-β.)图4 TGF-β诱导组HCE细胞在培养后0和24 h光镜下细胞迁移情况(a)和细胞相对迁移率(b)Fig.4 Cell migration (a) and the relative migration rate (b) of HCE induced by TGF-β after cultured for 0 and 24 h

实验结果表明，两种分子量的CMCTS均能够抑制Smad2和Smad3分子的磷酸化，从而阻断TGF-β/Smad信号通路，发挥抗纤维化的作用；而两种分子量的CMCT都不具有这种作用。

(n=3, mean±SD, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。* denotes significant difference compared with the group treated only with TGF-β.)图5 两种分子量的CMCTS作用1 h后P-Smad2 (a)，总Smad2 (b)，P-Smad3 (c)和总Smad3 (d) 的western blot结果Fig.5 Western blot analysis of P-Smad2 (a), total Smad2 (b), P-Smad3 (c) and total Smad3 (d) treated with CMCTS-1 or CMCTS-2 for 1 h

2.3.2 CMCTS和CMCT作用24 h对TGF-β/Smad信号通路关键因子蛋白总量的影响 由图7可见，CMCTS和CMCT作用24 h后，TGF-β诱导组和非诱导组细胞Smad2和Smad3分子的总量均没有明显的差异(P>0.05)，结果以GAPDH标准化。实验结果显示，CMCTS和CMCT对HCE细胞内源性Smad2、3分子的总量和TGF-β诱导的TGF-β/Smad信号通路激活之后Smad2、3分子的蛋白总量均不会产生影响。

3 讨论

本研究探讨了不同分子量的CMCTS和CMCT对TGF-β诱导的人角膜上皮细胞纤维化的抑制作用及其作用机制。在生物医学领域的应用中，生物大分子通常用于材料的制备，起到细胞或组织载体支架的作用；而小分子更容易穿过组织细胞屏障进入靶器官，直接发挥其生物活性的作用；所以本研究分别选取了不同分子量的多糖作为研究对象，以期为不同应用方向提供更全面的理论支持。本实验表明，不同分子量的CMCTS和CMCT对正常HCE细胞均表现出良好的相容性，其中，两种分子量的CMCTS对TGF-β诱导的HCE细胞纤维化均具有显著的抑制作用，而两种分子量的CMCT不具有这种作用。

(n=3, mean±SD, P>0.05)图6 两种分子量的CMCT作用1 h后P-Smad2 (a)，总Smad2 (b)，P-Smad3 (c)和总Smad3 (d)的western blot结果Fig.6 Western blot analysis of P-Smad2 (a), total Smad2 (b), P-Smad3 (c) and total Smad3 (d) treated with CMCT-1 or CMCT-2 for 1 h

除此之外，已有多项研究表明，CMCTS在多种组织或器官中表现出抗纤维化和抑制瘢痕粘连的作用。崔娟娟等[15]研究发现CMCTS能够有效的抑制术后腹膜组织的纤维粘连，Huang等[16]证实CMCTS对烧伤后皮肤组织的瘢痕形成具有抑制作用，Ren[17]等的研究也显示CMCTS能够阻碍子宫角术后的粘连。但是，CMCTS抗纤维化作用的机制尚未明确，本实验对此做出了进一步的探究。

TGF-β被认为是角膜纤维化疾病发生的关键因子[18]，在眼表损伤修复过程中，其持续升高最终引起角膜上皮细胞的纤维化和眼表瘢痕形成。TGF-β/Smad信号通路是TGF-β诱导的纤维化过程中最主要的分子通路[19]，TGF-β通过与细胞膜表面的相应受体结合，激活Smad2和Smad3分子的磷酸化，活化的P-Smad2和P-Smad3与Smad4分子结合，进入细胞核发挥转录因子的作用[20]。因此，本实验以TGF-β通路Smad分子为研究的起始点，就不同分子量的CMCTS和CMCT对角膜上皮的抗纤维化作用机理进行了研究，为其在角膜损伤修复中的应用提供必要的理论依据。

进一步的实验证明，CMCTS的抗纤维化作用与抑制了TGF-β/Smad信号通路中Smad2和Smad3分子的磷酸化有关，从而阻断了TGF-β/Smad信号通路，发挥其抗纤维化的作用；而CMCT不具备这种性质。同时，CMCTS或CMCT不会在磷酸化过程中以及这一过程之后，对Smad分子的总量产生明显影响。然而，本研究中仍存在一些问题，体外培养的HCE细胞并不能完全等同于人角膜上皮细胞，因此，深入研究CMCTS的抗纤维化作用及机理仍需要下一步的动物活体实验。

(n=3, mean±SD, P>0.05)图7 CMCTS和CMCT作用24 h后TGF-β非诱导组总Smad2 (a)， 诱导组总Smad2 (b)，非诱导组总Smad3 (c) 和诱导组总Smad3 (d) 的western blot结果Fig.7 Western blot analysis of total Smad2 (a, b) and Smad3 (c, d) in TGF-β induced and non-induced groups after cultured with CMCTS or CMCT for 24 h

4 结语

本实验研究发现CMCTS对TGF-β诱导的HCE细胞纤维化具有明显的抑制作用，并初步证实这种抗纤维化作用与抑制TGF-β/Smad信号通路中Smad2和Smad3分子的磷酸化有关，为CMCTS在眼组织工程中的应用提供了必要依据，同时也为探究CMCTS抗纤维化作用的机制提供了新思路。

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责任编辑 徐 环

Inhibitory Effect of CMCTS or CMCT on Corneal Epithelial Fibrosis Induced by TGF-β

WANG Zhe-Ying1, SUI Ai-Hua2, XU Wen-Hua1,LIU Cheng-Yu1, ZHOU Quan2, WANG Li-Ping2, LIANG Ye2

(1. College of Medicine, Qingdao University,Qingdao 266003, China; 2. Central Laboratory, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

In this study,carboxymethyl chitosan (CMCTS) and carboxymethyl chitin (CMCT) with different molecular weights were explored on their anti-fibrosis effect and the affecting mechanism. The effects of different kinds of CMCTS and CMCT on the growth of the human corneal epithelial cell line (HCE) were measured by MTT assay, while their anti-fibrosis effects on the migration of HCE cells were reflected by wound healing assay. The anti-fibrosis mechanism of different kinds of CMCTS and CMCT in corneal epithelia reconstruction was further studied on protein level. Results showed that CMCTS and CMCT with different molecular weights all suited the proliferation of HCE cells within the concentration of 10～1 000 μg/mL. But the two kinds of CMCTS could exert inhibitory effect on the fibrosis of HCE cells induced by TGF-β, and the anti-fibrosis mechanism was related to reducing phosphorylation of Smad2 and Smad3 protein in the TGF-β/Smad signaling pathway.Therefore, the two kinds of CMCTS could be applied in the repair of human corneal epithelial injury, playing an important role in anti-fibrosis.

carboxymethyl chitosan; corneal epithelia; fibrosis; TGF-β

山东省科技发展计划项目(2014GHY115025)；山东省自然科学基金培养基金项目(ZR2014HP011)资助 Supported by the Science and Technology Development Foundation of Shandong Province of China(2014GHY115025); Natural Science Foundation of Shandong Province(ZR2014HP011)

2016-04-06；

2016-05-26

王哲颖(1991-)，女，硕士生。E-mail：qd_wzhy@163.com

❋❋ 通讯作者：E-mail：qd_lchy@163.com；qd.wh@163.com

Q539+.7

A

1672-5174(2017)07-096-09

10.16441/j.cnki.hdxb/20160115

王哲颖， 隋爱华， 徐文华, 等. 羧甲基壳聚糖及羧甲基甲壳素对TGF-β诱导的角膜上皮纤维化的抑制作用研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(7): 96-104.

WANG Zhe-Ying, SUI Ai-Hua, XU Wen-Hua, et al. Inhibitory effect of CMCTS or CMCT on corneal epithelial fibrosis induced by TGF-β[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(7): 96-104.