蒙药地格达-4味汤在D-GlaN致急性肝损伤大鼠血清移行成分的LC-MSDTrap分析Δ

巴根那 包明兰 白梅荣 何那拉 佟玉风 叶日贵

(内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

实验研究

蒙药地格达-4味汤在D-GlaN致急性肝损伤大鼠血清移行成分的LC-MSDTrap分析Δ

巴根那 包明兰*白梅荣 何那拉 佟玉风 叶日贵

(内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000)

目的：分析蒙药地格达-4味汤在D-GlaN致急性肝损伤大鼠血清移行成分。方法：以地格达-4味汤水提物为示例药物、以D-GlaN致急性肝损伤大鼠为研究对象，应用液质联用仪和核磁共振仪对急性肝损伤大鼠灌胃给药地格达-4味汤后的血清中移行成分进行LC-MSDTrap分析。结果：灌胃给药地格达-4味汤后，在以D-GlaN致急性肝损伤大鼠血清中供检测到9个移行成分，其中4个移行成分为地格达-4味汤原型成分，即，4-O-β-glucopyranosylacetophenone、草夹竹桃苷、獐牙菜苦苷、Sweroside；5个移行成分为代谢产物。结论：所建立的测定方法比较全面、系统地分析地格达-4味汤血中移行成分，为揭示地格达-4味汤抗急性肝损伤药效物质基础提供科学依据。

蒙药地格达-4味汤；急性肝损伤；血清；移行成分；LC-MSDTrap分析

蒙药地格达-4味汤始载于《诊治明医典》，1998年被载入《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》是蒙医临床常用于清热、保肝、利胆的复方制剂。本复方由肋柱花、胡黄连、栀子、瞿麦等4味药材组成，具有清血热、分解精华与糟粨等功效。主要用于血热相搏、肝胆热、咽喉肿痛，口渴干燥等多种病症[1]。目前，地格达-4味汤的研究主要集中在保肝药理作用及獐牙菜苦苷、胡黄连苷II及栀子苷等主要化学成分的动态变化方面[2-4]，而地格达-4味汤保肝药效物质基础尚未清楚。

药物起作用的前提是必须被吸收入血。因此，本文从药物的临床应用为切入点，分析地格达-4味汤在D-GIaN致急性肝损伤大鼠(病态))血清中的移行成分，为后续探讨地格达-4味汤体内直接作用物质与药效相关性研究提供基本信息数据，为揭示地格达-4味汤保肝作用的物质基础提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器：Agilent 1100 series LC-MSD液质联用仪(Agilent SL型多级离子阱质谱仪，低压四元梯度泵，二级管陈列检测器(DAD)，chemistation化学工作站)；KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器(昆山)；NA-5L氮气空气一体机；TD4-I型离心机(长沙)；AUW120D型分析天平(上海)；固相萃取小柱-WAT094226? Waters OAsis HLB 3cc/60mg，30um(上海)。

1.2 药品与试剂：地格达-4味汤自制(肋柱花采自扎鲁特旗自然保护区特金罕山，经内蒙古民族大学蒙医药学院布和巴特尔教授鉴定，是龙胆科植肋柱花Lomatogonium carinthiacum (Wulf) Reichb.的干燥全草；胡黄连、栀子、瞿麦：内蒙古通辽市泽强医药有限公司提供)。D-GlaN(批号58461)由美国，Sigma公司提供。色谱2甲醇，甲酸。

1.3 实验动物：取Wistar大鼠，SPF级，雄性，许可证号码：SCXK(吉)-2011-0004：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

2 分析条件

2.1 色谱条件：色谱柱：VenusilMPC18(4.6*300mm，5μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱(0～10min，10～20%B；10～20min，20～40%B；20～40min，40～60%B；40～60min，60～75%B；60～80min，75～85%B；80～90min，85～10%B)；流速：1.0mL·min-1；检测波长：280nm；柱温：35℃；进样量：30μL。

2.2 质谱条件：ESI电离源：电喷雾离子源；检测模式：正离子扫描；扫描范围：m/z50～800；干燥气温度：350℃；干燥气流量：9.0mL·min-1；雾化气压强：35.0psi(1psi=6.895kpa)；毛细管电压：4kv。

3 实验方法

3.1 D-GlaN致急性肝损伤模型的复制：取20只大鼠，体重220±10g，按体重随机分为空白组、模型组，每组10只，模型组按400mg·kg-1剂量腹腔注射D-GlaN生理盐水染毒造模，空白组灌胃等量生理盐水，禁食不禁水21h后，从腹主动脉取血，3000r·min-1离心10min，取上清液，检测ALT、AST血清指标[5]，结果见表1。

表1 D-GlaN致急性肝损伤模型血清ALT、AST 含量的影响

注：与空白组比较*P<0.05；

3.2 含地格达-4味汤血清样品的制备：取30只大鼠，体重220±10g，按体重随机分为空白组、模型组、药物组，每组10只，模型组与药物组按“3.1”方法水染毒造模，造模成功后，药物组按1.44g·kg-1(按提取率换算)剂量灌胃地格达-4味汤水提物，空白组灌胃等量生理盐水，给药45min后，从腹主动脉取血，3000r·min-1离心10min，取上清液，备用。

3.3 含地格达-4味汤血清样品的处理：分别精密吸取含地格达-4味汤组血清、空白组血清和模型组血清各500μL，用20μL85%的磷酸酸化后加入活化(2mL甲醇、2mL水)的HLB固相萃取柱，分别以2mL水、2mL10%甲醇和3mL70%甲醇洗脱，弃去前两段洗脱液，收集70%的甲醇洗脱液，氮气发生仪上吹干样品[6]。用200μL甲醇溶解，过0.22μm微孔滤膜，制备相应的含地格达-4味汤组血清、空白组血清和模型组血清样品，备用。

3.4 地格达-4味汤血清中移行成分的LC-MSDTrap分析：精密吸取含地格达-4味汤组、空白组和模型组血清样品溶液各30μL，按“2”分析条件进行检测。记录相应的总离子图和二级质谱图，结果见表2和图1～10。

表2 地格达-4味汤血清中移行成分的正离子 扫描模式的质谱分析结果

图2 1号移行成分的结构 图3 2号移行成分的结构

图4 3号移行成分的结构 图5 4号移行成分的结构

图6 5号移行成分的结构 图7 6号移行成分的结构

图8 7号移行成分的结构 图9 8号移行成分的结构

图10 9号移行成分的结构

4 实验结果

4.1 D-GlaN致急性肝损伤模型血清ALT、AST含量：与正常组比较，模型组的血清ALT、AST活性明显升高，具有统计学意义(P<0.05)。提示模型复制成功。

4.2 地格达-4味汤血清中移行成分的LC-MSDTrap分析结果：应用LC-MS分析含地格达-4味汤组、空白组和模型组血清样品，比较了质谱检测方式，发现在正离子模式下，质谱响应更强，并且峰容量更大，故选择ESI正离子模式。

鉴定过程在本次实验色谱条件下，含地格达-4味汤血清中共检测到13个移行成分峰，除了空白组和模型组血清固有移行成分以外，含地格达-4味汤血清中与药物有关的有9个移行成分，其中4个移行成分是地格达-4味汤原型成分、5个移行成分是体内产生的代谢物(图1)。对这些移行成分首先精确计算出ESI-MS上所得化合物的分子质量，初步鉴定其化学成分[7-10]。然后，选择合适的分子离子峰进行裂解，通过二级质谱裂解方式，获得与化合物结构相关的碎片离子，再对比其他碎片信息，结合紫外吸收波长、分子质量、碎片离子峰、保留时间等参数，进一步推断5个代谢产物的结构；根据1H-NMR、13C-NMR及相关文献报道数据确定4个原型成分的结构(表2和图2-10)。

以獐牙菜苦苷为例。首先，通过该峰的准分子离子峰m/z397.5，可确定其目标分子量为374.1，根据m/z397.5的二级质谱裂解图进行分析，发现所得二级质谱图(图11)中有明显的m/z379.3[M+ Na-OH]+、217.1[M+Na-OH-C6H10O5]+、255.1[M+Na-OH-C6H4O3]+、165.1[M+Na-OH-C6H4O3-C7H10O3]+等碎片离子信息，从而推断出其裂解途径(图12)。结合保留时间、紫外吸收波长、碎片离子等参数，最终确定该峰为獐牙菜苦苷。采用类似的方法，对其他移行成分也进行相应的鉴定。

图1 含地格达-4味汤组(A)、模型组(B)及 空白组(C)血清总离子流图

图11 獐牙菜苦苷二级质谱图

图12 獐牙菜苦苷裂解途径

5 讨论

药物口服后，多数所含成分不能被吸收，只有部分成分被吸收进入体内，而进入体内的成分既可能以原型，也可能以代谢物的形式发挥作用。真正起作用的是吸收入血的成分，即血清中的移行成分。另外，由于蒙药成分较复杂，有些成分在肝脏的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的作用下生物转化为代谢产物后才能更具有较强的生理活性。因此，从含地格达-4味汤血清中分析得到的以上9个血中移行成分可能是地格达-4味汤化学成分的体内作用形式，它们最有可能成为地格达-4味汤的抗急性肝损伤药效物质基础。但被吸收入血的成分不一定都是有效成分，所以血中移行成分的活性与地格达-4味汤临床疗效的相关性，还有待进一步研究。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册[S].1998.91.

[2]巴根那，高玉峰，青玉，等.蒙药地格达-4味汤对小鼠化学性肝损伤的实验研究[J].时珍国医国药，2009，20(12)：3031～3033.

[3]高玉峰，巴根那，巴图德力根，等.蒙药地格达-4味汤对D-GlaN致小鼠急肝损伤的保护作用[J].中国中医药科技，2010，17(1)：26～27.

[4]白梅荣，巴根那，拉喜那木吉拉，等.地格达-4味汤中獐牙菜苦苷在急性肝损伤模型大鼠体内药代动力学研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(6)：125～128.

[5]翟亚南，王晶晶，李梦，等.D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导小鼠慢性肝损伤模型的建立[J].中国比较医学杂志，2014,24(5)：62～65.

[6]王喜军.中药血清药物化学[M].科学出版社，2010.109.

[7]李强,朱晓红.三黄汤HPLC指纹图谱初步研究[J].中药新药与临床药理,2015,(1):87～91.

[8]毛艳，张瑞萍，贺金华，等.紫草中萘醌类化学成分的快速高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术分析[J].中国药房，2014,25(43)：4090～4092.

[9]邹忠杰，龚梦鹃，谢媛媛，等.氢化可的松诱导的肾阳虚大鼠尿液代谢组学研究[J].中国实验方剂学杂志，2012,18(8)：133～136.

[10]王晓燕，张丽，王添琦，等.栀子化学成分的UHPL-Q-TOFMS分析[J].中药材,2013,36(3)：407～410.

2016年12月15日收稿

LC-MSD Trap Analyze the transitional components of Mongolian medicine Digeda-4 in serum of acute liver injury of rats induced by D-GIaN ba-genna Bao-minglan*bai-meirong he-nala tong-yufeng ye-rigui

(College of Mongolian Medicine and Pharmacology，Inner Mongolian

University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000，China)

Objective:To analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in serum after administration of stomach.Methods:With extract is an example of drugs to D-GlaN induced acute liver injury in rats as the research object，The application of LC-MS and NMR on acute liver injury in rats after intragastric administration of LC-MSD Trap placeality analysis of transitional components of -4 Decoction in the serum.Results:After administration of stomach for the Digeda-4，The nine transitional elements were detected in rat serum，four transitional elements were the Digeda-4denoction's prototype components that 4-O-β-glucopyranosyl，Phlox glycosides，Swertia bitter glycosides，Sweroside，5 transitional components were metabolites.Conclusion:The established method could comprehensively systematically analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in blood，to reveal to Digeda-4 decoction provide a scientific basis for anti-liver injury in acute pharmacodynamic material basis.

Mongolian medicine Digeda-4 decoction;acute liver injury;serum;the analyze of transitional elements:LC-MSD Trap Analysis

国家自然基金项目(81360673)

巴根那(1960-)男，教授，博士，博士生导师，研究方向：蒙药新药开发研究，bagenna@126.com;

*通讯作者：包明兰(1979-)女，副教授，博士，研究方向：方剂作用机理研究，baominglan@126.com

R291.2

A

1006-6810(2017)04-0046-04