南瓜叶不同极性部位体外抗氧化活性的研究

孙崇鲁++吴浩　汤小蕾　俞松林

[摘要] 目的 研究南瓜叶不同极性部位的体外抗氧化活性。 方法 采用系统溶剂法将南瓜叶的乙醇提取物分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水等5种不同极性溶剂萃取得到5种萃取物，以抗坏血酸为阳性对照，测定各萃取物的总还原能力、二苯代苦味酰基（DPPH）自由基清除能力、羟自由基清除能力和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除能力，通过比较半清除率浓度（IC50）的大小判断各萃取物的抗氧化能力强弱。 结果 南瓜叶不同极性部位均具有一定的抗氧化性，其中乙酸乙酯极性部位和水提部位的抗氧化能力最强，清除ABTS自由基的IC50分别为0.0389 mg/mL和0.0272 mg/mL，清除羟基自由基的IC50分别为0.2731 mg/mL和0.3474 mg/mL，清除DPPH自由基的IC50分别为0.1847 mg/mL和0.1876 mg/mL，在总还原能力上，乙酸乙酯极性部位和水提部位明显强于其他三个极性部位。同一提取物在不同的评价体系中表现出不同的抗氧化能力，可能与其所含成分及活性氧的性质有关。 结论 南瓜叶提取物的乙酸乙酯相和水相的抗氧化作用强，是天然抗氧化剂的良好来源。

[关键词] 南瓜叶；不同极性部位；抗氧化活性

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（a）-0021-04

Study on the antioxidant activities of different polarity extracts from Pumpkin leaves in vitro

SUN Chonglu WU Hao TANG Xiaolei YU Songlin

School of Pharmaceutical， Zhejiang Pharmaceutical College， Zhejiang Province， Ningbo 315100， China

[Abstract] Objective To study the in vitro antioxidant activities of different polarity fractions extracted from Pumpkin leaves. Methods Based on polarity， five extracts were obtained by using different organic solvents including petroleum， chloroform， ethyl acetate， n-butyl alcohol and water. Their antioxidant activities were evaluated by the reduction capability and scavenging capability of DPPH， ABTS， hydroxyl free radical with ascorbic acid. The antioxidant activities of various extracts were compared using half clearance rate （IC50）. Results Each part of extracts from Pumpkin leaves expressed antioxidant activities， while ethyl acetate and water extracts expressed the highest antioxidant activity. The IC50 for ABTS， ·OH and DPPH of ethyl acetate and water extract were 0.0389 mg/mL and 0.0272 mg/mL， 0.2731 mg/mL and 0.3474 mg/mL and 0.1847 mg/mL and 0.1876 mg/mL， respectively. For total reducing capacity， ethyl acetate and water extracts of polar fractions were stronger than other three polar parts. However， the same sample had different antioxidant activity with different evaluation method， and it may be related to its components and the nature of reactive oxygen species. Conclusion The ethyl acetate and water fractions of Pumpkin leaves showed strong antioxidant activities and it can be a kind of good source for natural antioxidants.

[Key words] Pumpkin leaves； Different polarity fractions； Antioxidant activity

南瓜屬葫芦科南瓜属一年生蔓生草本植物[1]，是人们喜爱的一种保健蔬菜食品。南瓜具有良好的栽培特性，对环境的适应性、抗逆性、抗病虫害能力都很强，种类繁多，地域分布广，耐粗放管理，生产成本低，高产耐贮，是我国一种重要的经济作物[2-3]。南瓜富含南瓜多糖、维生素、β-胡萝卜素、氨基酸、矿质元素等营养成分。在民间，南瓜药食两用已有几千年的历史，世界各国均有南瓜治病食疗的记载[4-5]。然而，迄今为止，对南瓜叶的研究却远远不及南瓜的研究。南瓜叶除了很少量被食用和作为饲料外，大部分被随意丢弃而白白浪费了，而据《岭南草药志》[6]记载，南瓜叶有清热、消炎、镇痛、祛瘀等作用，南瓜茎绞汁或南瓜叶晒干研末涂敷伤口，可治各种烫伤、烧伤和刀伤。

目前关于南瓜叶的研究报道很少，国内研究主要集中在对南瓜叶中黄酮类化合物的提取工艺及含量测定上[7-9]。熊建华等[10]研究了南瓜不同部位的抗氧化活性，结果表明，南瓜叶总提取物具有较强的抗氧化性。本研究采用清除二苯代苦味酰基（DPPH）、羟基自由基（·OH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）及总还原能力四种体外模型，综合评价南瓜叶不同极性部位的抗氧化能力，旨在为南瓜叶的提取和南瓜叶综合开发利用提供理论参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

南瓜叶采自慈溪市鸣鹤镇双湖村农田，由浙江医药高等专科学校王和平教授鉴定为南瓜叶，50℃鼓风干燥24 h以上，粉碎后备用；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，C18H12N5O6，相对分子质量394.3，纯度97%）：日本东京化成工业株式会社；ABTS（C18H24N6O6S4，相对分子质量548.68，纯度99.4%）：阿拉丁试剂有限公司；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、双氧水均为市售的分析纯。

1.2 仪器

LABOROTA 4000旋转蒸发仪：德国海道夫公司；UV-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；数显恒温水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；超声波清洗器：Sigma仪器有限公司；AL204型万分之一电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司。

2 方法

2.1 南瓜叶乙醇提取不同溶剂萃取物的制备

准确称取140 g的南瓜叶粉末置于2000 mL圆底烧瓶中，用70%的乙醇溶液进行提取，其中料液比为1∶6（g/mL），提取温度为60℃，提取时间为2 h，将提取物减压过滤，再重复2次，减压浓缩得到南瓜叶的乙醇提取物。将南瓜叶乙醇提取物加水混悬，分别依次用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇进行萃取，直到有机层无色为止。减压浓缩后，分别得到石油醚部分浸膏（Ⅰ）3.89 g、乙酸乙酯部分浸膏（Ⅱ）1.00 g、氯仿部分浸膏（Ⅲ）0.47 g、正丁醇部分浸膏（Ⅳ）4.13 g、水层浸膏（Ⅴ）4.15 g。所得的萃取物均冷藏备用。

2.2 抗氧化活性评价方法

2.2.1 ABTS自由基的清除作用[11-12] 用蒸馏水将ABTS溶解，配制成浓度为7 mmol/L的ABTS，然后加入过硫酸钾使其浓度为2.5 mmol/L，将该溶液在室温下避光反应12～16 h，制成ABTS+·储备液。临用前用pH=7.4的磷酸盐缓冲液稀释至适当浓度，使其在波长734 nm条件下的吸光度值为0.7左右，得到ABTS自由基工作液。在试管中加入1.0 mL不同质量浓度样品溶液，再加入2.0 mL的ABTS自由基工作液，混合、摇匀，在室温下反应6 min后，在波长734 nm条件下测定其吸光度（Ai），以不同质量浓度的抗坏血酸（VC）溶液作为阳性对照。用95%的乙醇代替样品溶液测得吸光度（A0）；2.0 mL的95%乙醇溶液代替ABTS溶液，测得吸光度（Aj），ABTS自由基清除率的计算公式如下：

清除率（%）=[1-（Ai-Aj）]/A0×100。 （1）

2.2.2 总还原能力的测定 分别称取南瓜叶不同溶剂萃取物，用少量二甲亚砜溶解后，用70%乙醇进行定容，配制成一系列浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的待测溶液，参照Apáti等[13]的方法测定待测溶液的还原能力。

2.2.3 ·OH的清除作用[14-15] 以水杨酸作为Fenton试剂反应产生的·OH的捕捉剂，对南瓜叶不同极性部位的抗氧化活性进行筛选。分别向试管中加入南瓜叶不同极性部位不同质量浓度的样品溶液2.0 mL，然后再分别加入1.8 mmol/L硫酸亚铁溶液2.0 mL和1.8 mmol/L水杨酸-乙醇2.0 mL，最后加入双氧水（0.03%）0.1 mL用以启动反应，用振荡器混合均匀，37℃水浴保持30 min，在波长为510 nm 下测量各自的吸光度Ai，用蒸馏水代替双氧水所得到的吸光度为空白对照A0，以70%乙醇代替样品溶液作为本底液吸光度Aj，南瓜叶不同极性部位不同质量浓度的样品溶液对·H的清除率按式（1）计算，并用VC代替样品做阳性对照，每组做3个重复，求其平均值。

2.2.4 DPPH自由基清除作用[16-17] 取南瓜叶不同质量浓度的样品和VC溶液1.0 mL，分别加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中，暗处室温反应30 min，以95%乙醇溶剂做空白对照，测量其在波长517 nm处的吸光度（Ai）。测定2.0 mL DPPH 95%乙醇溶液與1.0 mL 95%乙醇混合后在波长517 nm处的吸光度（A0）；测定2.0 mL 95%乙醇溶液与1.0 mL样品溶液在波长517 nm 处的吸光度（Aj）。按式（1）计算其清除率，并计算其半清除率浓度（IC50）。

3 结果

3.1 南瓜叶不同极性部位对ABTS自由基的清除作用

各提取部位对ABTS自由基均有一定的清除作用，但均低于同质量浓度VC的清除率。其中三氯甲烷部分清除效果较差，石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分及水提部分清除ABTS自由基效果较明显。清除率大小依次为水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物（图1）。其中水提部分在浓度为0.1 mg/mL时，其清除率为89.08%。根据表1的回归方程可得到，乙酸乙酯部分和水提部分的IC50的值分别为0.0389、0.0272 mg /mL。

3.2 南瓜叶不同极性部位总还原能力的测定

在实验测定范围内随着样品浓度的增大，南瓜叶乙醇提取物不同极性部位还原力均不断增强，但在相同浓度下，还原能力始终弱于VC。其中水提部分的还原能力明显高于其他极性部位，还原能力大小依次为水提物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物（图2）。根据表1的相关性分析可知，石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物以及水提物的质量浓度与吸光度的相关系数（R2）分别为0.9994、0.9972、0.9899、0.9953， 0.9981，表明南瓜叶不同极性部位还原能力与质量浓度之间有良好的相关性。

3.3 南瓜叶不同极性部位对·OH的清除作用

随着南瓜叶不同极性部位质量浓度的增加，南瓜叶不同极性部位提取物对·OH清除能力也随之提高，但始终低于相同质量浓度VC的清除率。当质量浓度为0.5 mg/mL时，乙酸乙酯极性部位对·OH的清除率达到65.40%，水提物的清除率也达60.39%（图3）。由表1可知，乙酸乙酯提取物和水提取物的IC50值为0.2731、0.3474 mg/mL，南瓜叶不同极性部位清除·OH的能力由强到弱依次为乙酸乙酯提取物>水提物>三氯甲烷提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物。

3.4 南瓜叶不同极性部位对DPPH自由基清除活性研究

在实验测定范围内，南瓜叶不同极性部位提取物对DPPH自由基的清除能力随着样品质量浓度的增加而提高，但均低于同质量浓度VC的清除率。当样品质量浓度为0.5 mg/mL时，乙酸乙酯部分、水提部分的清除率分别达到88.08%、72.17%。三氯甲烷部分在质量浓度为0.5 mg/mL时，清除率仅为26.22%（图4）。由表1可知，乙酸乙酯提取物、水提物的清除DPPH自由基的IC50分别为0.1847 mg/mL和0.1876 mg/mL，根据IC50值评价南瓜叶不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力的强弱，IC50值越小，清除能力越好。南瓜叶不同极性部位对DPPH自由基清除能力大小依次为乙酸乙酯提取物>水提物>石油醚提取物>正丁醇提取物>三氯甲烷提取物。

4 讨论

越来越多的医学研究报告证明，许多慢性疾病包括心血管、消化、内分泌、呼吸等方面的疾病，都与人体内累积了过多的自由基有关[18-21]。天然抗氧化植物化学物来源广，副作用小，其“药食同源”的优势符合现代营养免疫学理念，具有无限的开发前景和广阔的需求市场。

本研究通过对南瓜叶乙醇提取物不同极性部位抗氧化能力的比较，得出南瓜叶不同极性部位均具有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯极性部位和水提部分的抗氧化能力最强。在实验测试范围内，抗氧化能力随着样品质量浓度的增大而增强。这表明，乙酸乙酯极性部位和水极性部位与南瓜叶中大多数抗氧化性物质的极性接近，可以作为南瓜叶抗氧化活性成分研究的主要极性部位进行深入研究。下一步的研究中，笔者将以抗氧化活性为导向，继续对乙酸乙酯部位和水提部位进行活性成分分离与结构鉴定，试图找到真正起抗氧化作用的活性物质。本研究为南瓜叶的开发和利用提供实验数据，也为深入挖掘南瓜叶在食品医学领域的应用提供一定的参考依据。

[参考文献]

[1] 江苏新医学院.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，1985：1555-1560，3225.

[2] 许舒雯，陈龙胜，彭丽华.南瓜果肉中色素的研究[J].安徽农业科学，2015，43（36）：142-144.

[3] 赵一鹏，李星峥，周俊国.世界南瓜生产现状及其种群多样化特征[J].内蒙古农业大学学报：自然科学版，2004， 25（3）：112-115.

[4] 张培旗，常志娟，纵伟，等.南瓜叶的研究进展[J].食品工业，2011，32（3）：98-100.

[5] Adams GG，Imran S，Wang S，et al. The hypoglycaemic effect of pumpkins as anti-diabetic and functional medicines [J]. Food Research International，2011，44（4）：862-867.

[6] 广东省中医药研究所，华南植物研究所.岭南草药志[M].上海：上海科学技术出版社，1961.

[7] 李琴，杨婷婷.南瓜叶中总黄酮含量测定[J].新鄉医学院学报，2010，27（2）：134-135.

[8] 徐海菊.南瓜叶中总黄酮的提取工艺优化研究[J].浙江农业科学，2009，（3）：626-628.

[9] 刘清波，李文芳，李加莲，等.南瓜茎·叶·花中黄酮类化合物含量的初步研究[J].安徽农业科学，2006，34（13）：3182-3183.

[10] 熊建华，闵嗣璠，董开发，等.南瓜不同部位抗氧化活性的比较[J].食品研究与开发，2011，32（11）：135-138.

[11] 景临林，马慧萍，范小飞，等.甘松不同溶剂提取物的抗氧化活性研究[J].化学研究与应用，2014，26（10）：1591-1596.

[12] 张小娜，邹先伟，李莹，等.茯砖茶不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J].中国医药导报，2014，11（10）：9-13.

[13] Apáti P，Szentmihályi K，Kristó ST，et al. Herbal remedies of Solidago-correlation of phytochemical characteristics and antioxidant properties [J]. J Pharm Biomed Anal， 2003，32（4-5）：1045-1053.

[14] 孔令茜，梁晓霞，何敏，等.乌奴龙胆乙醇提取物不同极性部位体外抗氧化性研究[J].天然产物研究与开发，2015， 27（4）：651-654.

[15] 李维峰，王娅玲，郭芬，等.定心藤醇提物不同极性部分的体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2015，36（14）：107-110.

[16] 许本善，雷宁，吕亚丽，等.雪灵芝醇提物不同极性萃取部分的体外抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2015， 21（2）：61-64.

[17] 贾东升，李荣乔，谢晓亮，等.连翘叶不同溶剂提取物体外抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2016，37（2）：14-18.

[18] 黄韵璇，李海峰，黄泽波.天然药物抗氧化活性物质研究进展[J].广东药学院学报，2016，32（4）：532-536.

[19] Lee J，Koo N，Min DB. Reactive oxygen species，aging and antioxidative nutraceuticals [J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2004，3（1）：21-33.

[20] 郭玉文，曹婧然，何立杰.细胞水平的抗氧化机制研究进展[J].医学综述，2016，22（1）：13-16.

[21] 徐阳，邹翔，曲中原，等.天然药物有效成分抗氧化作用及机制研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2015， 31（3）：259-262.

（收稿日期：2016-08-15 本文编辑：王红双）