利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠ES细胞H2-K1基因*

陈瑞俊， 李蔚然， 黄乙涓 ， 刘建中， 李亮平,2

(1. 中山大学中山医学院生物学教研室，广东 广州 510080；2. 暨南大学附属第一医院临床医学研究院，广东 广州 510632)

利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠ES细胞H2-K1基因*

陈瑞俊1， 李蔚然1， 黄乙涓1， 刘建中1， 李亮平1,2

(1. 中山大学中山医学院生物学教研室，广东 广州 510080；2. 暨南大学附属第一医院临床医学研究院，广东 广州 510632)

利用CRISPR/Cas9和ES细胞技术，在小鼠ES细胞株上敲除小鼠H2-K1基因，为研发MHCⅠ类基因人源化小鼠打下基础。设计了两个单向导RNA(singleguideRNA，sgRNA)，分别靶向H2-K1基因的外显子2和外显子3。以pX330质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用电穿孔转染法将构建好的质粒以及pSUPER-puro共同导入小鼠ES细胞中，实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后，利用PCR初步检测靶基因的敲除情况，再通过测序以及流式细胞分析确定敲除H2-K1基因的小鼠ES细胞。结果显示：利用CRISPR/Cas9技术，小鼠ES细胞的H2-K1基因被成功敲除，通过PCR检测到4个克隆为H2-K1单等位基因敲除(19.0%)，2个克隆为H2-K1双等位基因敲除(9.5%)。经过测序以及流式细胞分析，2株小鼠ES细胞被确认为H2-K1双等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技术得到H2-K1基因敲除的小鼠ES细胞株, 为MHCⅠ类基因的敲除和置换提供了参考。

H2-K1 基因；CRISPR/Cas9技术；mES细胞；基因敲除

肿瘤免疫治疗是通过生物制剂直接或间接地诱发或者增强机体的抗肿瘤免疫应答以及破坏肿瘤的免疫抑制效应，达到抑制肿瘤生长或者直接杀伤肿瘤细胞的效果[1]。肿瘤免疫治疗的进展之一是特异性T细胞免疫治疗，而T细胞肿瘤免疫法中一个很重要的进展是T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)基因治疗的发展。……